茶渣发酵菌株的筛选、鉴定及生物学分析

胡桂萍， 杨 广， 宋凤琴， 方雅君， 黄琼瑶， 尤民生, 石旭平(.福建农林大学应用生态所, 福建 福州 35000; .江西省蚕桑茶叶研究所, 江西 南昌 3300)

茶叶作为我国特有饮料，为功能性保健食品，经分析茶叶中含有咖啡碱、单宁、茶多酚、蛋白质、碳水化合物、游离氨基酸、叶绿素、胡萝卜素、维生素B、维生素C、维生素E、维生素P以及无机盐、微量元素等400多种成分。因此大量的茶饮食品，茶医药产品，茶日化用品等深加工产品被开发，茶产业迅速发展。然而随着茶叶深加工生产的同时产生了大量的茶渣。如何对茶渣进行有效利用，是茶产业部门和茶叶科研工作亟需解决的课题。目前，已有利用茶渣为原料提取茶蛋白，茶纤维，或者利用茶渣开发生产肥料的研究报道(罗红玉等，2010；王素霞，2006；周小玲等，2007；沈连清等2007；蔡志宁等，2008)。其中，利用茶渣生产茶菌肥，通过微生物发酵，将废茶渣全部消化，使剩余的有效成分回归土壤，减少茶渣的环境污染，不仅符合生态环境的可持续发展需求，更有利于提高茶叶生产的附加值。浙江大学茶学系通过微生物发酵后并添加适量的N、P、K元素，成功开发有机——无机复混肥(屠幼英和陈利燕，2009)。而茶渣开发生产肥料的关键在于发酵菌株的选择。有效的发酵菌株，不仅有助于茶渣有机物质的转化，还能刺激作物生长，提高作物产量、品质及抗病性。邱富林等(2008)将茶渣有机无机复合肥进行椪柑生产的田间试验得到该肥料可促进椪柑新梢生长、提高其产量和品质。目前，已报道用于茶渣生产茶菌肥的发酵菌株较少，加大茶菌肥发酵微生物的筛选和收集是茶菌肥产业化的技术前提，本实验以福建大闽食品公司提供的废茶渣为原料，添加兔粪作为氮源，固态高温发酵生物肥，并从中分离发酵微生物，对其进行鉴定和生物学分析，为进一步实现茶菌肥资源化利用提供菌株来源和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶渣来源 茶渣由福建大闽食品公司提供

1.1.2 培养基 马铃薯培养基(PDA)：马铃薯(去皮)200 g，葡萄糖 20 g，水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 以茶渣为碳源，兔粪为氮源，3:1体积混合，置于60 ℃固体发酵2个月。

1.2.2 茶渣发酵微生物的分离 茶渣发酵菌株的分离方法如下：取已被发酵过的茶渣至于马铃薯培养基上，至于60 ℃培养箱中，厌氧培养3-5 d。用接种针挑取形态不同的菌株的菌丝分别轻点到马铃薯培养基中， 置于60 ℃恒温培养箱中培养3-5 d，纯化2-3次。

1.2.3 茶渣发酵菌株的ITS鉴定 茶渣发酵菌株的ITS鉴定参照邢红梅等(2009)，具体步骤如下：

(1)菌丝体的培养与收集：菌株接种在PDA培养基上活化，于60 ℃暗培养3-5 d后，用灭菌解剖刀刮取菌丝，置于5 mL塑料离心管中，真空冷冻干燥24-48 h后，在离心管中用玻璃棒将其捣碎成菌丝粉，置于-20 ℃保存备用。

(2)真菌DNA的提取：取各待测菌株的菌丝粉0.2 g分别置1.5 mL的Eppendorf管中，加900 μL CTAB提取液，90 μL 10%的SDS溶液，振荡混匀，55℃水浴1 h，12 000 r/min离心15 min。取上清液，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，轻轻颠倒混匀，12000 r/min离心10 min。取上清液加等体积氯仿轻轻混匀，12 000 r/min离心10 min，取上清液加入1/10体积的NaAc、2倍体积的冰乙醇，在-20℃下沉淀1 h，12 000 r/min离心10 min。弃上清液，70%的乙醇洗涤1次，干燥后溶于30 μL双蒸水中备用。

(3)ITS扩增：用真核生物核糖体DNA通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。其序列为ITS1: 5'-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG-3', ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

(4)PCR反应条件：PCR的反应混合液的总体积为25 μL，包括相应浓度的模板DNA，0.15 μmol引物，4种dNTP各50 μmol，2.5 μL 10×PCR反应缓冲液，2 mmol Mg2+, 1.25单位Taq酶(Promega)，混合离心后加1滴矿物油，在PCR仪上进行扩增反应。反应程序为：94℃预变性5 min；然后进入循环，94℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共31个循环，最后72 ℃延伸7 min。

胶回收PCR产物，连接在PMD182T载体上，转化E.coliJM109，在加有Amp的LB平板上筛选阳性转化子。用菌落PCR验证阳性转化子，并委托上海生物有限责任公司测序。

(5)ITS序列分析：将菌株的核糖体DNA-ITS序列与GenBank中核酸数据库(http://www.ncbi.nlm.gov.blast)进行同源性比较。同时用MEGA5.1构建分子发育系统树。

1.2.4 茶渣发酵菌株的形态学鉴定 将真菌接种到PDA培养基上，60 ℃恒温培养5 d，观察菌落形态与颜色，再在显微镜下观察其产孢结构、分生孢子梗着生情况及孢子形态、大小、颜色等。

1.2.5 发酵菌种生长曲线测定 将筛选到的发酵菌株，C-1，C-2，C-3和C-4，接种于含有茶渣浸提液的PDA固体培养基中，置于培养箱中培养，每天定点采用十字交叉法测量菌落生长直径，每个菌株接种三次。

2 结果与分析

2.1 茶渣发酵菌株的分离

以茶渣为碳源，兔粪为氮源，3:1体积混合，置于60℃发酵2个月，经PDA培养基分离培养，共分离到4株真菌，分别为C-1，C-2，C--3，C-4。菌落形态如图1所示，菌株C-1菌落棉絮状，黄色；菌株C-2，绒毛状，白色；菌株C-3棉絮状，暗灰色；菌株C-4菌落棉絮状，乳白色。

2.2 茶渣发酵菌株的ITS鉴定

提取发酵菌株C-1，C-2，C-3，C-4的基因组DNA，并进行ITS扩增，得到大小约为600 bp扩增产物(图2)，扩增产物经上海生工测序，测序结果与NCBI中的GeneBank数据库比对，从比对结果可知，分离得到四株的真菌C-1，C-2，C-3，C-4分别隶属于米曲霉(Aspergillusoryzae)、毛霉菌(Mucormucedo)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、镰刀菌(Fusariumoxysporum)。通过软件MEGA5对发酵菌株进行系统发育树构建，见图3。

图2发酵菌株的ITS片段的扩增图3发酵菌株的系统进化树

Figure 2 ITS fragments amplification of fermenting strains Figure 3 The phylogenetic tree of fermenting strains

2.3 茶渣发酵菌株形态学特征

电镜下对4株发酵菌株进行菌丝和孢子形态进行微观观察，见图4和图5，菌株C-1菌丝为有隔菌丝，孢子棒球形；菌株C-2菌丝为管状分枝的无隔菌丝，形成球形、椭圆形、壁薄、光滑的孢囊孢子；菌株C-3菌丝为有隔菌丝，孢子为分生孢子，圆形；菌株C-4菌丝为气生菌丝，孢子为厚垣孢子。

图4 茶渣发酵菌株的菌丝形态Figure 4 Mycelial morphological characters of fermenting strains

图5 茶渣发酵菌株的孢子形态Figure 5 Spore morphological characters of fermenting strains

2.4 发酵菌株生长曲线

将4株发酵菌株接种在含有茶渣滤液的固体PDA平板上生长，检测其生长情况，如图6，菌株C-2生长最快，第4天开始菌落直径就超过6 cm，并于第6天菌落直径达到8 cm；其次依次为菌株C-4，C-3；而菌株C-1生长最慢，第7天菌落直径还未达到7 cm。

图6 发酵菌株的生长曲线Figure 6 Growth curve of fermenting strains

3 讨论

利用微生物发酵的方法来处理茶渣，使得茶渣中氨基酸含量提高，纤维素含量减少，开发出不同种类饲料添加剂是茶产业实际生产中值得开发和研究的课题，目前相关研究有，但是不多，主要的技术难题是缺乏有效的发酵菌种和相关的发酵工艺。本研究模拟堆肥发酵，从废茶渣发酵堆中筛选到四种发酵真菌，米曲霉(Aspergillusoryzae)、毛霉菌(Mucormucedo)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、镰刀菌(Fusariumoxysporum)。对其在含有茶渣滤液的PDA固体培养基生长曲线测定发现，菌种毛霉菌生长最快，该菌种可能在茶渣茶菌肥资源化产业中具有重要的应用前景。Amit等(2009)也利用固态发酵，筛选到一株黑曲霉(AspergilusnigerARNU-4)可将茶渣生产葡糖酸。邱深本(2005)用木霉菌发酵除去木质素后的茶渣和废茶，并进行饲喂动物，发现发酵产物可以为动物提供52%以上的营养物质。刘姝和涂国全(2001)采用微生物固态发酵技术，利用茶渣为主料，以曲霉和木霉为发酵菌种，通过固态发酵可以米晓娜改善茶渣蛋白含量和营养价值。筛选有效的茶渣发酵菌株，并采用微生物固体发酵是茶渣废弃物质开发利用成有利用物质，如饲料添加剂，茶菌肥等，新的有效的利用途径。

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