钙网蛋白介导的线粒体功能异常参与心肌细胞肥大过程

单 虎，魏 瑾，张 明，林 琳，闫 蕊，张 蓉

(西安交通大学医学院第二附属医院心内科，陕西西安 710004)

心肌细胞肥大是心脏在病理条件下维持正常功能的有效代偿机制，然而心肌细胞肥大失代偿可导致扩张性心肌病、心力衰竭和猝死的发生[1-2]。线粒体功能异常是参与心肌细胞肥大及失代偿过程中的重要机制[3]，主要表现为线粒体膜电位降低，数目减少，聚集伴肿胀[4]，线粒体DNA突变增多[5]以及线粒体内活性氧水平升高[6]。然而，肥大刺激[血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内皮素-1、胰岛素样生长因子-1等]导致线粒体功能异常的机制尚未明确。目前，研究已初步证实NADPH氧化酶、线粒体σ1受体及线粒体KATP通道等参与肥大刺激介导的线粒体损伤[7-8]。钙网蛋白(calreticulin, CRT)是一种主要分布于内质网的钙离子结合蛋白，除参与调节蛋白折叠、细胞钙稳态和细胞黏附外[9]，CRT还可通过影响线粒体膜电位和钙稳态调节线粒体功能[10]。而且，在心肌细胞肥大过程中CRT表达水平明显升高[11]。但是，CRT诱导的线粒体功能异常是否参与心肌细胞肥大尚未证实。本研究拟采用AngⅡ构建大鼠心肌细胞肥大模型，观察模型细胞中CRT表达和线粒体功能的变化及AngⅡ受体阻断剂对它们的影响。

1 材料与方法

1.1材料新生SD大鼠(雌雄不拘)购自西安交通大学医学院实验动物中心；胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶(MP公司)，5-溴脱氧尿核苷(Brdu，Sigma公司)；DMEM/F12培养基(Thermo公司)，胎牛血清(Gibco公司)；α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体(Santa Cruz公司)，CRT单克隆抗体(CST公司)，Alexa Fluor 594标记二抗、罗丹明123(Invitrogen公司)，Hoechst 33258(上海碧云天)；AngⅡ(Sigma公司)，酶活性检测试剂盒(南京建成)；Tris-Carb系液闪仪(Perkinelmer公司)、Hoefer转膜仪、实时定量PCR仪(Bio-Rad公司)，荧光酶标仪、分光光度仪(上海天普)、倒置相差显微镜(Olympus公司)。常规试剂均为国产分析纯。

1.2新生大鼠心肌细胞原代分离培养与鉴定5只1 d龄SD大鼠消毒后移入超净台，无菌条件下迅速取出心脏，将左心室部分剪碎后移入1 g/L胰蛋白酶与0.5 g/L Ⅱ型胶原酶混合消化酶中，在37 ℃恒温摇床中消化7 min后吸取上清液与等体积含100 mL/L血清的完全培养基混合，重复消化8～10次。将所收集上清离心后以含100 mL/L血清的完全培养基(含100 U/mL青链霉素及0.1 mmol/L Brdu)重悬后置于37 ℃细胞培养箱内培养90 min，采用差速贴壁法去除贴壁的非心肌细胞。取培养第4天的心肌细胞常规固定通透后，以1∶200稀释α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体4 ℃孵育过夜，1∶200稀释的Alexa Fluor 594标记二抗室温孵育2 h，Hoechst 33258标记细胞核，荧光显微镜下观察。

1.3实验分组将同期分离培养的心肌细胞随机分为5组：模型组，共3组，分别以10-8mmol/L、10-7mmol/L、10-6mmol/L终浓度的AngⅡ干预48 h；缬沙坦组以10-6mmol/L终浓度缬沙坦预处理0.5 h后，再加入10-7mmol/L终浓度的AngⅡ继续干预48 h；空白对照组不予任何处理。

1.4心肌细胞表面积的测定各组心肌细胞干预结束后，于倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态，每组随机挑选10个视野，各视野下随机挑选10个细胞，于40倍物镜下摄片。用Image-Pro Plus专业图像分析软件测量细胞表面积，各组细胞表面积用该组100个细胞表面积的平均值代表。

1.5蛋白质合成速率的测定采用3H-亮氨酸掺入法，各组心肌细胞干预结束后，PBS冲洗2遍，用含0.2 g/L EDTA的2.5 g/L胰酶将细胞消化为单细胞悬液，离心后以含1 μCi/mL3H-亮氨酸的PBS 1 mL重悬细胞，37 ℃水浴1.5 h后将心肌细胞转移至玻璃纤维滤膜上，以100 g/L三氯乙酸固定滤膜并烘干，将烘干后的滤膜放入含5 mL闪烁液的测定瓶中，用液体闪烁仪测定滤膜放射性。

1.6线粒体膜电位的测定将罗丹明123配制成5 μg/μL的母液，用PBS漂洗贴壁生长的心肌细胞3次，再各孔中加入含5 μg/mL终浓度的新鲜培养液，放入孵育箱中继续培养30 min，吸弃培养液，PBS轻轻洗涤细胞3遍，于荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长488 nm，发射波长分别为535 nm和590 nm，红色与绿色荧光强度比值反映膜电位水平。

1.7酶活性测定按照酶活性检测试剂盒说明书操作，于分光光度仪550 nm和600 nm波长分别检测COX和SDH活性。

1.8RT-PCR检测使用Trizol试剂提取细胞总RNA，随后用RT-PCR试剂盒(TaKaRa)进行反转录，按照SYBRExScriptTMRT-PCR试剂盒说明在iQ5多色实时定量PCR检测系统上进行操作。CRT引物设计为5′-TTCTTGGACGGAGATGC-3′(正义)，5′-CATCTTGGCTTGTCTGC-3′(反义)；GAPDH，5′-TTGTGATGGGTGTGAACC-3′(正义)，5′-TTCTGAGTGGCAGTGATG-3′(反义)。以NADPH为内部对照，采用2-ΔΔCt相对定量法计算各组中CRT基因表达。

1.9Westernblot检测使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白质浓度，分别取300 μg蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，继而转印到PVDF膜，常规封闭后分别用CRT单克隆抗体(1∶1 000)及β-actin单克隆抗体(1∶3 000)4 ℃孵育过夜，PBST洗涤后以相应二抗室温孵育2 h，ECL法显影并于暗室内曝光。以β-actin作为内部对照，采用Image-Pro Plus图像分析软件分析各蛋白条带的积分吸光度值。

1.10统计学方法采用SPSS 18.0统计软件分析，数据以均数±标准差表示，两组间的比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1原代培养乳鼠心肌细胞的纯度鉴定在培养的心肌细胞中以α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体为一抗，经免疫荧光细胞化学鉴定，心肌细胞纯度在90%以上(图1、表1)。

图1原代培养乳鼠心肌细胞的纯度鉴定(免疫细胞化学染色)

Fig.1 The identification of neonatal rat cardiomyocytes (immunocytochemistry)

A：实验组(×40)；B：实验组(×100)；C：阴性对照组(PBS代替一抗，×40)。

表1以α-横纹肌肌动蛋白的阳性率评定原代培养乳鼠心肌细胞的纯度

Tab.1 The purity of neonatal rat cardiomyocytes identified by α-sarcomeric actin positive rate

培养天数(d)阳性细胞数(个)细胞总数(个)阳性率(%)1976100097.62941100094.14905100090.5

2.2缬沙坦对AngⅡ诱导心肌细胞肥大的影响分别用3种不同浓度AngⅡ干预的模型组心肌细胞表面积、蛋白质合成速率明显高于对照组(P<0.01)，提示心肌细胞肥大模型构建成功。与3个模型组相比，缬沙坦组心肌细胞表面积、蛋白质合成速率均明显降低(P<0.05，图2)。

2.3缬沙坦对AngⅡ诱导心肌细胞线粒体功能异常的影响与对照组相比，3个模型组线粒体膜电位、COX及SDH活性均明显降低，而与3个对照组相比，缬沙坦预处理可有效抑制AngⅡ诱导的线粒体膜电位和酶活性下降(P<0.05，图3)。

2.4缬沙坦对AngⅡ诱导心肌细胞肥大中CRT表达的影响与对照组相比，模型组心肌细胞中CRT mRNA及蛋白水平随着AngⅡ浓度增大而逐渐升高，而与3个模型组相比，缬沙坦预处理可明显抑制CRT表达上调(P<0.01，图4)。

3 讨 论

CRT在调节心肌线粒体功能中的作用已经得到广泛的认同，而其是否在心肌肥大发生过程中参与线粒体损伤尚未得到证实。本研究通过体外实验观察了心肌肥大发生过程中CRT表达的变化及缬沙坦对其表达的影响。

图2各组细胞表面积、蛋白质合成速率的比较

Fig.2 Comparison of cell surface area and protein synthesis rate between the groups

A：各组细胞表面积；B：各组细胞蛋白合成速率。与对照组相比，*P<0.01；与缬沙坦组相比，#P<0.01。

图3各组细胞线粒体膜电位、呼吸链酶活性的比较

Fig.3 Comparison of mitochondrial membrane potential level and enzyme activities between the groups

A：各组细胞线粒体膜电位；B：各组细胞线粒体中呼吸链酶活性。与对照组相比，*P<0.05；与缬沙坦组相比，#P<0.05。

图4各组细胞CRT表达水平的比较

Fig.4 Comparison of CRT expression between the groups

A：各组细胞CRT mRNA相对水平；B：各组细胞CRT蛋白相对水平。与对照组相比，*P<0.01；与缬沙坦组相比，#P<0.01。

在我们构建的心肌肥大细胞模型中，3个浓度梯度的AngⅡ均可诱导原代心肌细胞出现细胞表面积增大、蛋白合成速率加快等肥大特征及线粒体膜电位、酶活性降低等线粒体功能受损表现，同时CRT表达水平随AngⅡ浓度增加呈现剂量依赖性升高，而缬沙坦预处理可消除AngⅡ诱导的CRT表达上调作用，并减轻AngⅡ诱导的线粒体功能损伤。结合既往研究所证实CRT表达上调可导致线粒体功能受损，上述实验能够初步证实：CRT介导的线粒体损伤可能参与心肌肥大过程。

CRT是一种主要分布在内质网中的钙结合蛋白，具有调节细胞内钙稳态、钙离子相关信号通路、基因表达和细胞黏附的生物学作用[12]。CRT在胚胎期心脏中表达较高，是心脏发育必不可少的重要因素[13]。然而，出生后心脏中CRT表达水平迅速下降，当CRT过度表达时则会出现心律失常、心腔扩大、心源性猝死等严重后果[14-15]。目前，CRT在心血管疾病发病机制中的作用得到越来越多研究者的重视，ARNAUDEAU等[10]已发现CRT介导线粒体钙稳态失衡是心肌细胞功能异常的重要机制。本课题组前期以扩张性心肌病大鼠模型为研究对象，发现其心肌组织中CRT表达升高，并伴随信号转导和转录激活子3(STAT3)磷酸化过程受阻，线粒体损伤发生；离体培养大鼠心肌细胞CRT表达下调后，STAT3磷酸化受阻及线粒体损伤得到部分逆转。由此可见，CRT通过CRT-STAT3信号通路介导的线粒体损伤参与扩张性心肌病的发病过程[16]。早在1997年，TSUTSUI等人就已经发现压力负荷诱导的心肌肥大模型中CRT表达异常升高，但其在心肌肥大过程中的具体作用及机制尚未明确。本研究发现心肌肥大细胞模型中CRT表达水平升高，并呈现AngⅡ浓度依赖性，同时，心肌细胞线粒体功能下降，而给予缬沙坦预处理后，AngⅡ不能诱导CRT表达升高，随着CRT表达水平的降低，线粒体功能也得到一定程度的恢复。因此，本实验结果可初步证实CRT介导的线粒体损伤参与AngⅡ诱导心肌肥大过程。

综上所述，在AngⅡ刺激下，CRT表达升高所诱导的线粒体功能异常可能是心肌肥大的重要机制之一。该研究有助于阐述心肌肥大过程中线粒体功能受损的可能机制，为进一步的基础与临床研究奠定了理论基础。

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