肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制及干预的研究进展

李满祥，卢家美

(西安交通大学医学院第二附属医院：1. 呼吸病研究室；2. 呼吸内科，陕西西安 710004)

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension, PAH)是一组由多种病因引起的肺血管床受累，导致肺血管阻力和肺动脉压力进行性升高为特征的临床综合征[1]。其发病机制包括肺血管紧张性增高、结构性重塑及原位血栓形成，其中肺血管重塑在各种类型的PAH发病中起关键性作用，而肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)的异常增殖是构成肺血管重塑的主要病理基础[2]。因此，探索介导PASMCs增殖的分子机制及相关干预是目前PAH领域的研究热点。本文就近年来与PASMCs增殖相关的分子信号机制做一回顾，并将相关干预研究的进展做一小结。

1 肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制

1.1RhoA/ROCK信号通路RhoA是Rho家族中重要的一员，隶属于Ras超家族小分子GTP蛋白。RhoA有GTP偶联(激活)和GDP偶联(失活)两种存在状态，多种细胞外活性介质可通过与其特异性受体结合激活与之偶联的RhoA蛋白分子。ROCK作为RhoA下游的主要靶分子，可传递或执行RhoA的多种细胞生物学功能。研究发现，RhoA/ROCK信号通路在多种生理及病理生理状态下起重要的作用，广泛参与细胞收缩、迁移、增殖、凋亡、炎症反应等的调控[3]。

早期研究发现，RhoA/ROCK信号通路介导了多种缩血管物质诱导的血管收缩，进一步研究证实该信号通路的活化与PASMCs增殖也密切相关[4]。本课题组研究发现，与多种PAH发病密切相关的5-羟色胺(5-HT)可于体外激活RhoA活性并诱导原代培养的大鼠PASMCs增殖，以药理学方法抑制RhoA/ROCK信号通路可阻断5-HT的上述效应[5]。TAJSIC等[6]研究发现，在缺氧引起的PAH模型中，RhoA/ROCK信号通路的活性增强，抑制该信号通路可明显抑制缺氧诱发的肺血管重塑。提示RhoA/ROCK信号通路介导了肺动脉平滑肌细胞增殖/肺血管重塑及其随后的PAH发生。

目前，认为RhoA/ROCK信号通路介导PASMCs增殖的下游分子机制包括两个方面[7-8]：①上调基质金属蛋白酶2(MMP2)的生成及分泌，破坏MMP/TIMP之间的平衡，促使细胞外间质破坏及降解，释放多种生长因子进而诱导PASMCs增殖；②活化的RhoA可促使磷酸化的ERK1/2 MAPK核转移，使其在细胞核内磷酸化下游的转录因子以启动相关基因的转录，通过调控增殖相关基因的表达介导了PASMCs的增殖。

1.2ERK1/2MAPK信号通路细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的成员之一，其活性改变与多种恶性肿瘤、心血管疾病、糖尿病等发病密切相关，多种细胞外刺激可激活该信号通路。ERK1/2 MAPK信号通路的激活遵循MAPK家族的3级酶促连锁反应。Ras作为其上游激活蛋白激活Raf(MAPKKK)，进而依次激活MEK(MAPKK)和ERK(MAPK)，完成了Ras-Raf-MEK-ERK信号途径的活化。该信号通路广泛参与细胞增殖、分化、存活/凋亡等多种生理、病理过程。

研究发现，ERK1/2 MAPK作为主要促细胞增殖的信号通路参与包括PASMCs在内的多种细胞的增殖。LI等[9]研究表明，5-HT可激活牛PASMCs中ERKl/2 MAPK信号通路，抑制该信号通路可明显抑制5-HT诱导的平滑肌细胞增殖。进一步的研究证实，在多种PAH动物模型中ERKl/2 MAPK信号通路的活性明显增强，并伴有明显的肺血管重塑；预先敲除ERK1/2基因，则可预防/阻断模型动物中肺血管重塑的发生及PAH的产生[10]。有研究提示，ERK1/2 MAPK介导PASMCs增殖的机制可能与其磷酸化相关的转录因子(例如，Sep-1a、EIK-1、Jun、Fos)，促进与细胞增殖相关基因的表达(如Cyclin D)相关[8]。

1.3PI3K/AKT信号通路PI3K/AKT信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡、葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K可经两种方式激活，一是活化的小分子G蛋白Ras与PI3K的p110亚单位(催化亚基)结合激活PI3K，另一种方式是酪氨酸激酶受体与多种生长因子结合导致受体二聚体化，从而激活受体的酪氨酸激酶，进而激活PI3K。激活后的PI3K可使细胞膜上的PIP2磷酸化为PIP3,进而激活蛋白激酶B(AKT)。AKT可激活或抑制下游多种靶分子，调控细胞的增殖、分化、浸润、转移、存活/凋亡等[11]。

研究发现，缺氧及生长因子可激活PASMCs中PI3K/AKT信号通路的活性，诱导平滑肌细胞增殖；抑制PI3K或AKT的功能可抑制缺氧及生长因子刺激的平滑肌细胞增殖，提示PI3K/AKT信号通路可特异性介导PASMCs的增殖[12]。WANG等[13]进一步发现，PI3K/AKT信号通路可通过差异性调节细胞周期蛋白的表达(上调Cyclin D和下调p27表达)，促进细胞周期进展，导致平滑肌细胞增殖。动物研究进一步证实，抑制PI3K/AKT信号通路可预防及治疗多种诱因导致的PAH的发生[14]。

1.4BMP/TGF-β-Smad信号通路骨形成蛋白(BMP)属于转化生长因子-β(TGF-β)家族的一员，广泛调节细胞的增殖、分化及凋亡[15]。BMP可使BMP受体Ⅰ(BMPRⅠ)与BMP受体Ⅱ(BMPRⅡ)形成异聚体，活化的BMPRⅡ激活BMPRⅠ，进而磷酸化下游多种亚型的Smad蛋白，使不同亚型的Smad形成异聚体并转移至细胞核，通过上调DNA结合抑制蛋白(Id)的表达，抑制bHLH类转录因子的活性，从而调控靶基因的转录，调节细胞的多种生物学功能[16]。

研究发现，BMPRⅡ基因突变在家族遗传性PAH及特发性PAH的发病中起重要作用[17]。BMPRⅡ基因突变可导致Smad 1/5活性降低，DNA结合抑制蛋白(Id)表达减少，削弱了其对平滑肌细胞增殖的抑制作用及促凋亡作用，导致PASMCs过度增殖，进而导致PAH的发生。新近研究发现，BMPRⅡ功能异常或表达减低亦可见于缺氧及野百合碱诱发的PAH动物模型中，提示恢复BMPRⅡ功能及表达可能对多种PAH的干预均具有重要意义[18]。

1.5钙激活的Calcineurin/NFAT信号通路Calcineurin/NFAT信号通路在介导细胞内钙信号传递过程中起重要作用。Calcineurin是一种钙离子/钙调蛋白依赖性丝氨酸、苏氨酸去磷酸化酶，可使胞质内活化T细胞核因子(NFAT)家族转录因子去磷酸化并转移至细胞核内，与其它信号通路调控的转录因子(AP1、GATA等)协同调控相关基因的转录，调节细胞收缩、增殖、分化、炎症反应等多种功能[19]。多种细胞外刺激及介质可通过诱导细胞外钙内流及细胞内钙释放激活该信号通路。

早期研究发现，Calcineurin / NFAT信号通路参与调控淋巴细胞炎症反应[20]，随后的研究证实该信号通路的激活介导了心肌细胞肥厚及多种肿瘤细胞增殖[21-22]。新近的研究发现, Calcineurin/NFAT信号通路与PAH的发生密切相关。本课题组的研究证实，Calcineurin/NFAT信号通路可特异性上调Cyclin A的表达并激活Cyclin依赖性激酶(CDK)，引起DNA合成增加及细胞周期进展，促进PASMCs的增殖进而参与PAH的发病[23]。体内研究证实，在缺氧诱发的PAH动物模型中可检测到Calcineurin/NFAT信号通路的激活，通过药理学方法抑制该信号通路可显著减轻肺血管重塑并抑制PAH的发生[24]。

1.6Notch3信号通路Notch系统是一个高度保守的细胞信号通路，与细胞的增殖、分化、收缩、迁移等细胞生物学功能密切相关。当Notch受体与其配基结合后，诱发两次连续的Notch受体裂解反应，释放出Notch受体的细胞内域(NICD)并进入细胞核，与细胞核内的转录因子C启动子结合因子-1(CBF1)结合，取代 CBF1与共抑制子(CIR、SKIP、SHARP、SMRT等)结合并召集共激活子，从而激活转录因子CBF1的活性，以调控相关基因的表达[25]。

研究发现，Notch3信号通路特异性的参与了PAH的发生。LI等[26]研究提示，在正常PASMCs中仅表达低水平的Notch3受体，但在PAH患者或动物模型中PASMCs的Notch3受体表达明显增加，且Notch3受体表达量与PAH的严重性呈正相关。体外实验也证实，Notch3信号通路的活化可刺激PASMCs增殖，而基因技术阻抑Notch3受体表达可抑制PASMCs的增殖[27]。但是，Notch3信号通路通过活化调控哪些靶基因的表达，进而导致PASMCs增殖，目前尚不清楚。

2 抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的干预研究

随着对PAH发病机制的深入研究，针对其发病机制中关键分子的靶向治疗已经越来越受到人们的关注。一些新型抗PAH药物不断出现，5型磷酸二酯酶抑制剂、内皮素受体拮抗剂、前列环素类似物等已经用于临床，用于数种PAH 的治疗[24]。体外细胞培养及动物研究提示，他汀类降脂药物、PPAR-γ受体激动剂、环孢素A等亦具有抑制PASMCs增殖的作用，有望成为治疗PAH的新方法。下文将对这些治疗药物做一概述。

2.15型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂西地那非是PDE5特异性抑制剂，已广泛用于多种类型PAH的治疗并取得良好效果，且耐受性较好[24]。该类药物的作用机制在于扩张肺动脉、抑制肺血管平滑肌细胞增殖。分子生物学研究提示，PDE5抑制剂从如下方面发挥抑制PASMCs的作用：①抑制cGMP的降解，通过激活PKG信号通路广泛抑制多个促平滑肌细胞增殖的信号机制[28-29]；②上调丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)的表达，去磷酸化ERK1/2，进而抑制ERK1/2 MAPK介导的PASMCs增殖[30]。

2.2前列环素类似物研究发现，PAH患者中前列环素合成酶的水平降低，前列环素的产生明显减少。前列环素治疗PAH的机制在于其扩张肺血管并抑制PASMCs增殖。前列环素在临床上用于PAH的治疗已有10余年的时间，可明显提高运动耐力，改善血流动力学指标，提高患者生活质量。但早期的前列环素类似物半衰期较短，需长期持续给药。目前长效前列环素类似物已用于临床，可口服、静脉及局部吸入给药[31]。前列环素抑制PASMCs增殖的分子机制在于：①通过刺激cAMP的产生，激活PKA从而抑制平滑肌细胞增殖[32]；②通过cAMP依赖性上调DNA结合抑制蛋白(Id)，抑制平滑肌细胞增殖[33]。

2.3内皮素受体拮抗剂内皮素(ET)不仅是一种重要的血管活性物质，还具有促进平滑肌细胞增殖的功能，在各种PAH发病中起重要作用。波生坦作为非选择性内皮素受体(ETR)拮抗剂，已在我国及欧美用于治疗WHO心功能分级为Ⅲ～Ⅳ级的动脉型及血栓栓塞性PAH。大量临床研究及循证医学证据证实，ETR拮抗剂可提高PAH患者运动耐量及生存率，显著改善血液动力学指标，但不引起体循环血压下降[34]。该类药物可阻断ET-1与ETR特异性结合后激活的促细胞增殖的Calcineurin/NFAT、RhoA/ROCK等信号通路，从而发挥抑制PASMCs增殖的作用[35]。

2.4他汀类降脂药他汀类药物是一种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，已作为降血脂药物广泛用于临床。研究证实，他汀类降脂药具有广泛的心血管保护作用，其机制不能以单纯的降血脂作用来解释[36]。进一步研究发现，该类药物可抑制PAH模型中的肺血管重塑，这与该类药物抑制PASMCs增殖有关[28]。他汀类药物抑制PASMCs增殖的机制与其抑制小分子G蛋白RhoA的激活及序列性上调HO-1和p21的表达以抑制细胞周期进展有关[37-38]。但是，目前他汀类药物用于PAH治疗的研究仅限于实验动物水平，其临床疗效尚有待进一步验证。

2.5PPAR-γ受体激动剂过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)是一种依赖配体激活的核受体转录因子，激活的PPAR-γ可与维甲酸受体X形成异二聚体进入细胞核内，调控相关基因的转录[39]。PPAR-γ可调控细胞的分化、增殖、代谢等多种功能，作为药物的治疗靶点，其激动剂罗格列酮已应用于糖尿病的治疗。目前的研究证实，激活PPAR-γ可抑制体外培养的PASMCs的增殖及模型动物中PAH的发生[40]。其抑制PASMCs增殖的机制在于序列性上调HO-1及p21WAF1的表达，抑制CDK活性，阻碍细胞G1→S期的进展[39]。需要注意的是罗格列酮在临床中表现出不良的心血管事件，使用此类药物需严密监测。但随着分子生物学技术的迅猛发展，高效价、安全的新型PPAR-γ受体激动剂必将有望研制成功，为PAH治疗带来广阔的前景。

2.6环孢素A环孢素A(CsA)作为一种强效免疫抑制剂已广泛用于器官移植后的排异反应，其作用机制在于CsA特异性抑制Calcineurin磷酸酶的活性，使其下游的转录因子NFAT不能去磷酸化活化，从而抑制其介导的免疫应答反应[41]。研究发现，Calcineurin/NFAT信号通路亦介导了体外PASMCs的增殖及PAH动物模型中肺血管重塑的发生，而CsA可抑制PASMCs的增殖及其动物模型中的肺血管重塑，从而抑制PAH的发生[28,42]，提示CsA具有潜在的治疗PAH的价值，值得进一步的研究验证。

3 结 语

肺动脉高压是一种发病机制复杂、预后极差的疾病。PASMCs与PAH的发病关系密切，其异常增殖是肺血管结构性重塑的关键病理基础，可导致血管紧张性增高、管壁增厚和管腔狭窄，致使血管阻力进行性升高，最终诱发PAH[43]。而持续的PAH可导致右心衰竭甚至死亡。因此，进一步探索PASMCs增殖的分子机制、寻求新的抑制其增殖的治疗靶点和有效治疗模式，是PAH治疗的关键和研究热点。

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