椒蒿挥发油对小鼠自身免疫性睾丸炎的影响

骆靖华，王春娥，斯依提尼沙汗·吾满尔，玛衣拉·阿不拉克

(1.新疆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，新疆乌鲁木齐 830011；2.南京医科大学附属无锡市 人民医院检验科，江苏无锡 214231；3.新疆维吾尔自治区维吾尔医院药剂科，新疆乌鲁木齐 830054)

世界卫生组织报道，在男性不育的病例中，有2.9%为免疫因素造成。在原发性不育症和继发性不育中，免疫性不育分别占2.7%、4%。自身免疫性睾丸炎是免疫性不育的一个重要因素。自身免疫性睾丸炎是生殖免疫学疾病中的一种，主要是由于血睾屏障的破坏从而引起精子抗原的暴露，精子对男子是种自身抗原，可引起自体抗体。临床研究表明，男性血液中的血清抑制素B(serum inhibin B, INHB)和卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)的高低与自身免疫性睾丸炎的进展具有一定的相关性。椒蒿具有较高食用和药用价值，其挥发油有茵香脑、烩烯和香叶烯等多种化合物，具有抗病毒、增强免疫功能的作用[1-2]，还可以清热祛风、利尿，治疗风寒感冒。目前，国内外还没有关于椒蒿挥发油对生殖免疫学方面的研究报道。本实验应用不同剂量椒蒿挥发油干预自身免疫性睾丸炎小鼠模型，观察睾丸组织的形态学变化并检测血清中INHB和FSH激素的水平，以明确椒蒿对小鼠自身免疫性睾丸炎预防和治疗作用。

1 材料与方法

1.1主要药品、试剂及仪器椒蒿采于新疆奇台，挥发油由新疆科学院提取[3]；血清INHB检测试剂盒(美国RD公司，批号：DZE22545573)；血清FSH检测试剂盒(美国RD公司，批号：DZE22545419)；氯胺酮注射液(江苏恒瑞制药公司)；地西泮注射液(江苏恒瑞制药公司)；阿托品注射液(天津金耀氨基酸有限公司)；生理盐水(NS，新疆医科大学第一附属医院提供)；EPON812环氧树脂(新疆奥宝公司)；其他试剂：蒸馏水、苏木素、伊红、生理盐水、甲醛、乙醇、丙酮、苦味酸等为市售分析纯。

1.2实验动物及分组健康成年雄性BALB/c小鼠150只(10周龄)，体质量18～25 g，购自新疆医科大学医学实验动物中心(许可证号为SCXK20022001)。

以完全随机化设计分为生理盐水组、模型组及椒蒿低、中、高剂量组。

1.3模型建立、处理及取材生理盐水组和模型组用生理盐水灌胃，椒蒿低、中、高剂量组用体积分数为0.938%、1.875%、3.375%椒蒿挥发油灌胃(查阅相似文献，根据预实验动物的耐受程度，确定了3种浓度)，各组剂量均为0.5 mL/只。各组小鼠均灌胃3 d后进行手术并单侧睾丸注射冰醋酸，均采用腹腔麻醉(氯胺酮+地西泮+阿托品三联药，剂量为0.1 mL/10 g)，仰卧位，固定四肢及尾部，在无菌条件下手术。切开右侧阴囊，生理盐水组只进行右侧阴囊切开，不注射冰醋酸即缝合，其余各组小鼠右侧睾丸注射100 mL/L冰醋酸0.03 mL，缝合阴囊。

手术后继续灌胃21 d并在同等条件下饲养至取材时间处死。即分别于术后3、6、9周取各组10只小鼠摘眼球取血约0.8～1.0 mL，抗凝取血清备用；取非手术侧睾丸组织制作石蜡切片，进行HE染色，光镜观察。

1.4ELISA法检测血清中INHB和FSH含量的变化将血清和试剂盒室温平衡30 min，设标准品10孔(复孔)，稀释，最终加样50 μL；37 ℃温育30 min，洗涤5次，加酶标试剂；37 ℃温育30 min，洗涤5次，加显色剂A液、B液混匀，37 ℃避光温育30 min，加终止液，以空白孔调零，450 nm波长测定各孔吸光度(A)值，以标准物的浓度为横坐标，A值为纵坐标，汇出标准曲线，根据样品的A值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

2 结 果

2.1一般性状的观察生理盐水组小鼠活动自如，进食正常。其余组小鼠术后前期活动减少，进食量少，随着术后时间的延长，活动、进食情况有所恢复。多次称量体质量，各组小鼠在实验期间体质量均有增长(P<0.05)，而各组与生理盐水组体质量相比差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1各组小鼠体质量的变化

Tab.1 The weight of the mice in each group

组 别造模前术后3周术后6周术后9周生理盐水组22.86±0.9227.87±0.63*27.87±0.63*32.52±0.59*模型组23.02±0.4727.22±2.73*30.13±1.33*32.73±0.88*椒蒿低剂量组22.68±0.5726.65±0.71*30.43±0.93*32.41±0.85*椒蒿中剂量组23.24±0.6227.23±1.85*30.73±0.85*32.79±0.77*椒蒿高剂量组23.09±0.8826.82±0.80*30.84±0.89*32.84±0.25*

同组中与造模前比较，*P<0.05。

2.2睾丸病理学观察结果生理盐水组双侧睾丸体积正常，质地饱满。其余各组术侧睾丸严重萎缩，与周围组织粘连。模型组及椒蒿低、中剂量组非术侧睾丸色灰白，质软与生理盐水组有差别。椒蒿高剂量组的非术侧睾丸术后9周颜色红润，质地饱满，与生理盐水组无明显差别。

光镜下非手术侧睾丸组织形态学各组结果为：生理盐水组睾丸生精小管分布均匀，各级生精细胞排列整齐，结构正常，管腔中有大量精子。模型组术后3周睾丸生精小管发生退行性变，由睾丸周围向中心逐渐加重，术后6周、9周略有好转。椒蒿低、中剂量组生精小管之间间隙增宽，管内生精细胞层减少，排列疏松，有空泡状结构，病变与模型组相比稍好，椒蒿高剂量组睾丸病变较轻，术后9周基本恢复(图1)。

图1 术后9周各组小鼠生精小管的病理变化Fig.1 Pathological changes of semi-niferous tubules 9 weeks after the surgery (HE, ×200)A:生理盐水组;B:模型组;C:椒蒿低剂量组;D:椒蒿中剂量组;E:椒蒿高剂量组。

2.3血清中INHB和FSH含量的变化术后3、6、9周，模型组及椒蒿低、中剂量组外周血INHB的含量均低于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)，FSH的含量均高于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)，椒蒿低、中剂量组INHB的含量均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，FSH的含量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；术后6、9周椒蒿高剂量组外周血INHB含量与生理盐水组相比差异无统计学意义(P>0.05)，术后9周椒蒿高剂量组外周血FSH含量与生理盐水组相比差异无统计学意义(P>0.05，表2、表3)。

表2各组小鼠外周血INHB含量的变化

组别术后3周术后6周术后9周生理盐水组12.11±1.2711.68±1.5211.41±1.53模型组3.88±0.97*5.76±1.29*6.54±1.37*椒蒿低剂量组7.02±1.22*◇8.10±1.84*◇8.30±1.51*◇椒蒿中剂量组6.84±1.05*◇8.54±1.18*◇8.73±1.53*◇椒蒿高剂量组9.49±0.89*10.14±1.7610.68±1.93

与同时间生理盐水组比较，*P<0.05；与同时间模型组比较，◇P<0.05。

3 讨 论

本实验观察结果显示椒蒿挥发油所使用的剂量范围与血清中的INHB和FSH的含量有密切联系。众所周知，男性生殖系统功能的正常发挥除了依赖于生殖器官的结构和功能正常外，还与体内的内分泌系统和一系列细胞因子精细调节、共同维持生殖内环境的稳态有密切关系。睾丸的生精功能是男性生殖功能的重要标志，睾丸生精功能主要受下丘脑-垂体-睾丸轴调控。下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(gonadotroph-releasing hormone, GnRH)作用于脑垂体使其合成和分泌FSH、LH等，在FSH的作用下，支持细胞等细胞合成并分泌抑制素。INH是Sertoli细胞所分泌的一种激素类蛋白质，越来越多的研究表明睾丸中的INH参与了垂体功能的调节。INH能够抑制腺垂体合成和分泌FSH，还可阻断下丘脑刺激引起的垂体FSH释放，对FSH的分泌发挥着极强的负反馈作用。它可以通过抑制FSH终止精子发生，但不影响睾丸间质细胞(leydig cell)分泌睾酮(testosterone, T)[4-6]。

表3各组小鼠外周血FSH含量的变化

组别术后3周术后6周术后9周生理盐水组20.57±1.4820.61±1.7420.89±2.26模型组46.46±7.02*44.67±6.02*39.15±5.70*椒蒿低剂量组38.95±5.69*◇36.34±7.38*◇32.10±5.60*◇椒蒿中剂量组39.69±3.89*◇36.39±5.11*◇28.18±5.74*◇椒蒿高剂量组33.71±3.89*29.90±4.59*22.34±2.32

与同时间生理盐水组比较，*P<0.05；与同时间模型组比较，◇P<0.05。

本实验在不同的椒蒿使用剂量组和时间点上，INHB与FSH的含量不同，剂量越高、时间点越长，其含量越趋向于正常值。形态学观察结果显示，使用椒蒿挥发油组的小鼠睾丸生精小管炎症进展缓慢，较没有椒蒿挥发油组明显减轻，剂量越高、时间点越长组的生精小管的结构越接近正常组织。说明椒蒿挥发油对小鼠自身免疫性睾丸炎具有一定的保护作用。以上结果可能与椒蒿挥发油具有改善微循环、抗炎、抗氧化等作用有关。通过我们实验过程中所测激素的变化，推测椒蒿挥发油具有促性腺激素样作用，促进垂体分泌促性腺激素，对下丘脑-垂体-性腺轴产生多层次的调节作用，从而纠正了自身免疫性炎症状态下所引起的下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱，保证机体激素水平平衡，促进睾丸组织的正常转化；椒蒿挥发油的有效成分对支持细胞有一种保护作用，使其免受炎症时的应激损伤，进而能在一定程度上促进和保护支持细胞中与生精相关的基因转录和翻译水平，有利于维护支持细胞的正常功能，对抑制素与FSH也有调节作用；椒蒿挥发油富含胡萝卜素等多种抗氧化物质[7]，是体内重要的抗氧化物和膜稳定剂[8-11]，在维持组织正常结构和代谢，特别是能量的供给及钙离子摄取、释放过程中发挥着重要作用。因此，补充胡萝卜素、维生素可以明显降低氧化应激[12-15]，能有效减少自由基对细胞膜、蛋白质、油脂、RNA和DNA的攻击和损伤，尤其是对DNA线粒体的诱发性攻击，对生精小管内环境起调节作用；椒蒿挥发油的有效成分可能对自身免疫性睾丸炎通路中的酶有抑制作用，这自然对睾丸炎的发生也具有一定的拮抗作用；椒蒿挥发油使用组小鼠在吸收挥发油后毛细血管扩张，改善微循环血流，使睾丸血流供应充足，再与抗炎等一系列作用结合，可能也是降低睾丸炎产生的重要机制；使用椒蒿挥发油后的小鼠免疫活性得到改善，改善体液免疫和细胞免疫活性，抑制炎症介质，促进新陈代谢，以此对睾丸的生精功能产生一个保护作用。

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