一株产琼胶酶海洋细菌的分离与鉴定

梅建凤,李 莎,茅鹤婷,王 鸿,应国清

(浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310032)

琼胶(agar)是一种从紫菜、石花菜和江蓠等海洋红藻中提取的多糖。琼胶由琼脂糖和硫琼胶组成,其中琼脂糖是由(l→3)-O-β-D-半乳糖和(1→4)-O-3,6内醚-α-L-半乳糖交替组成的琼二糖重复单位连接而成的线形链状分子。琼胶因其具有优良的胶凝性、稳定性、黏滞性和渗透性,因此在食品、医药和化工等领域有广泛的应用[1]。琼胶寡糖(agaro-oligosaccharide)就是琼胶经降解后聚合度为 2～10的低聚糖。近年来的研究表明琼胶寡糖有多种生理活性,如抗氧化、降血脂,免疫增强,抗过敏和抑制糖苷酶等活性,是一种极具开发潜力的功能低聚糖[2]。

由琼胶制备琼胶寡糖可以采用化学降解和酶降解 2种方法,相比于化学降解法,酶降解法具有寡糖得率高、生物活性高和工艺环保等优点。琼胶酶就是能够将琼胶水解为寡糖或单糖的酶类,它不仅可用于琼胶寡糖的制备,还可以应用于分子生物学研究中回收琼脂糖凝胶中的DNA和RNA;或作为工具酶用于海藻的单细胞分离、酶解破壁制备原生质体等[3-4]。目前,Sigma-Aldrich有限公司已有琼胶酶销售,其来自大西洋假单胞菌(Pseudomonas atlantica),价格昂贵,如纯度大于5 000 U/mg的产品,1 kU包装的价格为1854.45 元人民币[5]。因此,寻找一种产酶活性高、性状稳定、易于培养的琼胶酶产生菌仍是琼胶酶研究与应用的关键。本文从东海浙江海域采集了海水样品,进行琼胶酶产生菌的分离和筛选,并对得到的菌株进行形态学和 16S rDNA序列分子鉴定,确定该菌株的分类地位,旨在获得产酶活性高的菌株,为琼胶酶的研究和应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 海水样品

2份海水样品分别采自东海浙江省舟山市普陀区附近海域(采集点北纬 29.872811°N,122.404974°E)和东海浙江省临海市附近海域(采集点北纬28.779320°N,121.670580 °E)。

1.2 培养基

平板和斜面培养基 A(g/L): NaCl 25,NH4Cl 1,MgSO4·7H2O 5,KCl 1,FeSO4·7H2O 0.02,CaCl20.2,NaH2PO4·2H2O 0.6,琼脂 20,pH 7.0[6]。

斜面培养基B(g/L): 葡萄糖1,NaCl 20,酵母浸出粉 5,MgSO4·7H2O 5,KCl 1,FeSO4·7H2O 0.02,CaCl20.2,NaH2PO4·2H2O 0.8,琼脂 20,pH 7.5[6]。

产酶培养基(g/L): NaNO34,NaCl 10,MgSO4·7H2O 5,KCl 1;FeSO4·7H2O 0.02,CaCl20.2,NaH2PO4·2H2O 0.6,MnCl2·4H2O 0.15,琼脂 2.5,pH 7.0[6]。

以上培养基均采用121 ℃、20 min高压蒸汽灭菌;产酶培养基装250 mL玻璃三角烧瓶,每瓶装40 mL,8层纱布扎口。

所有实验试剂为均为市售分析纯或生物试剂。

1.3 方法

1.3.1 富集培养

海水样品50 mL于250 mL三角瓶中,加入0.15 g琼脂粉,30℃摇床培养7 d以上。

1.3.2 平板菌落筛选

将经过富集后的海水样品用无菌人工海水适当倍数稀释,取0.1 mL涂布平板,28 ℃培养至平板上长出菌落。观察菌落形态,挑取能形成明显凹陷的菌落划线接种于另一平板,28 ℃培养,将形成较深凹陷的单菌落挑至斜面培养基A上培养。

1.3.3 摇瓶培养筛选

挑取斜面菌株的菌苔 2～3环,接入产酶培养基中,28 ℃、200 r/min振荡培养48 h。取发酵液10 mL,4℃、8000 r/min离心15 min,取上清液测酶活力。初筛不做重复,淘汰酶活相对较低的菌株,同法对剩余菌株进行复筛,每个菌株做 3个重复的摇瓶培养,筛选出酶活最高的菌株。

1.3.4 酶活测定

酶活测定采用 DNS法[7]: 取磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH7.0)配制的2.5 g/L琼胶底物溶液9 mL,加入1 mL待测酶液,45℃、100 r/min水浴摇床中酶解20 min,立即取1 mL酶解液于刻度试管中,加入1 mL DNS溶液、1mL水,沸水浴5min后立即冷却至室温,定容至10 mL。于紫外可见分光光度计测定A540,再由 D-半乳糖浓度的标准曲线计算酶解液中的还原糖质量浓度。琼胶酶的活力定义: 在上述反应条件下,1mL酶液1min产生l μg还原糖作为一个酶活力单位(U/mL)。

1.3.5 16S rDNA序列分析

用EzupTM柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组总DNA,作为PCR模板DNA。扩增引物选用细菌鉴定通用引物: 正向引物27F: 5'-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3'(对应于E.coli 16S rRNA基因的第8～27个碱基位置),反向引物1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(对应于E.coli 16S rRNA 基因的第1492～1510个碱基位置)[8]。PCR反应体系(50μL): 2×PCR Master溶液25 μL(2×PCR Master包括3 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、0.1U/μL Tag DNA polymerase 和2×PCR buffer)。DNA模板1 μL,上下游引物各1 μL,ddH2O 22 μL。扩增程序: 94℃预变性3 min,94℃变性1 min,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环,72℃延伸10 min。取5 μL扩增样品,1%琼脂糖凝胶,80v电压电泳检测[9]。

引物合成及PCR扩增产物测序均由上海生工生物技术服务公司完成。

将测得的16S rDNA基因序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上通过BLAST比对,分析其与其他菌株的同源性。并选择相似度≥98%的菌株的16S rDNA基因序列,采用Mega5.1软件建立系统发育树。

2 结果和讨论

2.1 平板筛选

在本文采集海水的海域,并非海藻生长区域,但海水样品经过富集后,采用平板法分离,培养基上有大量琼胶酶产生菌生长。虽然菌落较小,多数菌落周围会出现较深的釜底形凹陷,在菌落密集的地方,平板培养基液化深至皿底(图 1),反映了这些菌株产酶活性较高。选取凹陷较深的菌落,转接斜面培养基A上培养,获得出了26株具有降解琼胶能力的菌株。

图1 平板分离琼胶酶产生菌的菌落照片Fig.1 Colonies of bacterial strains producing agarase in plate cultivation

2.2 初筛和复筛

平板筛选出的26株菌株转接斜面培养后,新鲜斜面菌体接种产酶培养基,摇瓶振荡培养48 h后,测定发酵液酶活,筛选出8株酶活相对较高的菌株。然后将这8个菌株再经斜面活化培养后,新鲜斜面菌种接种产酶培养基,每个菌株做3个重复,摇瓶振荡培养48 h后,测定各菌株的琼胶酶活力,计算平均值,结果见表1。

从摇瓶复筛的结果可以看出: 这些菌株的产琼胶酶活力菌均较高,其中菌株G-5的琼胶酶活力最高,达到413.8 U/mL。

表1 产琼胶酶菌株的摇瓶培养复筛产酶活力Tab.1 The agarase activity of some strains in the second screening by shaking cultivation

2.3 G-5菌株的菌落和菌体形态特征

对产酶活力相对较高的W-10、G-5和G-6进行了分类鉴定,结果发现这3个菌株的菌落特征、菌体形态以及16S rDNA序列均相同,说明它们是同一个种,所以本文以下仅报道G-5菌株的鉴定结果。

G-5菌株在平板培养基上培养7 d,菌落半透明,直径约为3～5 mm,在平板培养基上生长可以形成很深凹陷,甚至可使培养基开裂。在斜面培养基A上培养7 d,沿划线呈沟壑状,但菌体量较少(图2)。在斜面培养基B上培养,因含有葡萄糖和酵母浸出粉,一般24 h即可长满斜面,菌落周围无凹陷。对该菌种的保藏和分子生物学鉴定时,便采用斜面培养基B,可以缩短培养时间,获得更多的菌体。

图2 菌株G-5斜面培养菌落形态Fig.2 Colonies of G-5 on the slant culture

G-5菌株的菌体革兰氏染色呈阴性,菌体简单染色后在光学显微镜下观察,菌体呈短杆状,略有弧形,菌体大小0.58～0.69 μm×1.50～2.26 μm,菌体的光学显微镜照片见图3。

2.4 16S rDNA序列分析

提取G-5菌株的总DNA,利用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增,扩增产物电泳图表明,分子量在1500 bp左右,测序后得可用序列1458 bp。将测序所得基因序列在NCBI上通过BLAST比对,相似度在98%以及以上的菌株见表2,菌株G-5与这些弧菌的同源性关系见系统发育树(图4)。

图3 菌株G-5在光学显微镜下菌体照片Fig.3 Cell shape of G-5 observed under optical microscope

菌株G-5的16S rDNA序列与NCBI数据库中15株弧菌(Vibrio sp.)的16S rDNA序列相似度达到98%及以上,因此可以判断其是一株弧菌,但与这些菌株的亲缘关系均较远,尚不能依据16S rDNA序列比对将G-5鉴定到种。目前,已经分离到多株能够产琼胶酶的弧菌,如Aoki 等[10]分离到的Vibrio sp.AP-2;Sugano等[11]分离到的Vibrio sp.strain JT0107;Araki等[12]分离到的Vibrio sp.PO-303菌株;杜宗军等[13]分离到Vibrio tubiashii,因未能获得这些菌株的16S rDNA序列,无法将G-5与它们进行亲缘关系比较。NCBI数据库中有一株Vibrio tubiashii(登记号NR 026129.1),但从系统发育树来看,G-5与其亲缘关系较远。

3 结论

琼胶酶具有广阔的应用前景,自1957年Yaphe[14]第一次从海水中分离到能分解琼胶的细菌——大西洋假单胞菌(Pseudomonas atlantica),此后人们已经从海水系统中分离到了多株琼胶酶产生菌,虽然近年来从陆生环境分离到了一些降解琼胶的微生物,但海洋是琼胶酶产生菌生存的大环境,从海水中容易分离到琼胶酶产酶活性较高的菌株。本文通过平板菌落预筛和摇瓶初筛与复筛,从浙江省舟山市普陀区近海海水中筛选到一株琼胶酶高产菌株G-5,在平板和斜面培养时即可看出其产酶能力不同凡响,原始菌株液体培养的产酶活力可以达到413.8U/mL,如进一步对其进行诱变育种,优化其产酶培养基和培养条件,其产酶活力定能进一步提高,具有较高的工业化应用潜力。

表2 NCBI数据库中与G-5菌株BLAST相似度≥98%的菌株Tab.2 The Vibrio strains with similarity of ≥98% by BLAST in the database of NCBI

图4 依据16S rDNA序列同源性比较构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of the Vibrio sp.strains based on 16S rRNA gene sequence

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