直接肉汤药敏试验在猪病防治中的应用

刘跃生，潘陈苗，姚宁屏，邵忠海

（1.嘉兴职业技术学院，浙江嘉兴 314036；2.嘉兴市新塍镇畜牧兽医监督管理所，浙江嘉兴 314015）

直接肉汤药敏试验在猪病防治中的应用

刘跃生1，潘陈苗2，姚宁屏1，邵忠海1

（1.嘉兴职业技术学院，浙江嘉兴 314036；2.嘉兴市新塍镇畜牧兽医监督管理所，浙江嘉兴 314015）

为快速筛选出敏感兽药，减少盲目用药和细菌耐药性的产生，为临床兽医防治疾病提供依据，本研究以药物临床治疗剂量为基础，制备含药的药敏培养基，研发直接肉汤药敏试验方法。经6个试验组的试验证明，以直接肉汤药敏试验方法筛选的敏感兽药与临床疗效高度相符，待检样品中细菌分别对试验猪场常用兽药有一定耐药性；药敏试验前后防治效果的差异极其显著；直接肉汤药敏试验的重复性和稳定性高，准确率＞97%。直接肉汤药敏试验方法具有操作简便、快速，可定量的特点，有较高的临床应用价值，筛选并合理使用敏感药物，能显著提高临床治疗效果。

药敏试验；敏感兽药；临床疗效

近年来，我国猪场经常流行或散发不明原因的高热、拒食、呼吸困难、皮肤发红等症状的生猪疫病。据报道主要由猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒、猪丹毒杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌等病原混合感染引起［1］。实验室诊断生猪疫病后，一般采用纸片扩散法或肉汤稀释法对分离菌株进行药敏试验，前者只能定性检测细菌药敏性，后者定量检测药物最小杀菌浓度和最小抑菌浓度，但要求条件较高，操作烦琐，耗时较长，一般5d以上才能得出确诊和药敏结果［2］。在药敏结果出来前，仅凭兽医经验防治复杂疫病，往往导致延误最佳治疗时间，造成疫情反复、损失巨大。故实验室常规诊断及药敏试验方法在兽医临床应用上的价值受到限制。

为了寻求操作简便快速、临床实用、可定量，重复性和稳定性高的药敏方法，我们成功研发了直接肉汤药敏试验，取得了理想的防治效果，为兽医临床工作者有效控制动物疫情提供了新思路。现将有关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 制备药敏培养基

选择细菌干粉培养基（Mueller-HintonBroth，简称MH肉汤），购自杭州天和微生物试剂有限公司，产品执行标准YZB／浙0660—2009，细菌干粉培养基成分符合GB4789—28的要求，外观为细粉末状，产品批号在有效期内，细菌干粉培养基pH值为7.4，用于抗生素敏感试验。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。

准确称取干粉培养基36g，加入到1000mL蒸馏水中，煮沸充分溶解，补足水分，过滤、准确分装到小试管，每管5mL，盖上硅胶塞。121℃灭菌30min，37℃培养20h，无菌检验合格的放入4℃冰箱备用。

1.2 采集及制备待检样品

2012年11月至2013年10月，选择6个发病猪场作为试验组。

各组扑杀典型发病猪2～3头，无菌采集心包渗出液、胸腔积液等，每份病料采集1～2mL，混合后作为待检样品。

试验组1，初步诊断为猪肺疫、猪伪狂犬病，无菌采集3例病猪的心包液混合物。

试验组2，初步诊断为猪出血性胸膜肺炎、猪蓝耳病，无菌采集2例病猪的胸腔积液混合物。

试验组3，初步诊断为猪肺疫、猪蓝耳病，无菌采集3例病猪的胸腔积液混合物。

试验组4，初步诊断为猪出血性胸膜肺炎、猪气喘病，无菌采集2例病猪的胸腔积液混合物。

试验组5，初步诊断为副猪嗜血杆菌病、猪气喘病，无菌采集2例病猪的胸腔积液混合物。

试验组6，初步诊断为副猪嗜血杆菌病、猪出血性胸膜肺炎、猪气喘病，无菌采集2例病猪的胸腔积液混合物。

1.3 药敏培养基中试验兽药的剂量

药敏培养基以MH肉汤培养液5mL（5g）为基质，1mL肉汤培养液代表1个kg体重单位，以药物的高限临床治疗剂量1／1000为单位，计算药物的添加剂量。

例如，液体制剂的临床治疗剂量0.1～0.2mL· kg－1，试验选用高限0.2mL·kg－1，5mLMH肉汤试验管中应加入试验兽药原液1μL。固体制剂的临床治疗剂量如是3mg·kg－1，则5mL（5g）MH肉汤中应加入15μg兽药。

1.3.1 头孢噻呋钠的剂量

头孢噻呋钠，江西金康佳生化药业有限公司出品，批号20120718，规格0.5g·瓶－1，临床治疗3mg·kg－1，配制5mL试验剂量为15μg。

1.3.2 复方氨苄西林的剂量

复方氨苄西林，湖北省武当动物药业有限公司，批号20120701，规格0.5g·瓶－1，临床治疗3mg·kg－1，配制为5mL用15μg。

1.3.3 庆大霉素的剂量

庆大霉素，杭州钱浪药业有限公司，批号20120601，规格8万IU·2mL－1，临床治疗0.1 mL·kg－1，配制为5mL用0.5μL。

1.3.4 替米考星的剂量

替米考星，江西金康佳生化药业有限公司，批号20120608，规格3g·10mL－1，临床治疗0.15 mL·kg－1，配制为5mL用0.75μL。

1.3.5 林可霉素的剂量

林可霉素，湖北省武当动物药业有限公司，批号20120823，规格3.0g·10mL－1，临床治疗剂量0.1mL·kg－1，配制为5mL用0.5μL。

1.3.6 氟苯尼考的剂量

氟苯尼考，湖北省武当动物药业有限公司，批号20120720，规格2g·10mL－1，临床治疗0.1 mL·kg－1，配制为5mL用0.5μL。

1.3.7 硫酸粘菌素的剂量

硫酸粘菌素，湖南伟达生物科技有限公司，批号20120309，规格150万IU·2mL－1，临床治疗0.1mL·kg－1，配制为5mL用0.5μL。

1.3.8 10%恩诺沙星的剂量

10%恩诺沙星，江西金康佳生化药业有限公司，批号20120430，规格1g·10mL－1，临床治疗0.15mL·kg－1，配制为5mL0.75μL。

1.3.9 乳酸环丙沙星的剂量

乳酸环丙沙星，浙江大飞龙动物保健品有限公司，批号20120202，规格0.2g·10mL－1，临床治疗0.1mL·kg－1，配制为5mL用0.5μL。

1.3.10 复方磺胺嘧啶钠注射液（简称SD-TMP）的剂量

复方磺胺嘧啶钠注射液，浙江金力制药有限公司，批号20120625，规格1g＋0.2g·10mL－1，临床治疗30mg·kg1，配制为5mL150μg。

1.3.11 复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液（简称SMM-TMP）的剂量

复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液，湖南伟达生物科技有限公司，批号20120819，规格1g＋0.2g· 10mL－1，临床治疗0.2mL·kg－1，配制为5mL用1μL。

1.4 药敏试验结果判定标准和方法

每种试验兽药按设定剂量配制后，分别加入2支药敏试验管，以便重复对照，再加入待检样品10μL；另设不加抗菌药物及待检样品的MH肉汤空白对照管、不加抗菌药物而加待检样品10μL的MH肉汤细菌对照管各2支；分别充分混匀，经（35±2）℃培养18h，根据以下标准进行对比分析，筛选敏感药物。

药敏反应程度设5个级别：＋＋＋＋表示100%液体完全透明，无细菌生长，管底无凝集沉淀物；＋＋＋表示75%液体透明，有少量细菌生长，略呈混浊，管底有极少量凝集沉淀物；＋＋表示50%液体透明，有部分细菌生长，中等程度混浊，管底有少量凝集沉淀物；＋表示25%液体透明，有多量细菌生长，明显混浊，管底有较多凝集沉淀物；－表示100%液体不透明，有大量细菌生长，有明显凝集沉淀物，振荡呈均匀混浊。

试验对照管必须达到标准：MH肉汤空白对照管，100%液体完全透明，无细菌生长，管底无凝集沉淀物，以＋＋＋＋标记；MH肉汤细菌对照管，100%液体不透明，有大量细菌生长，有明显凝集沉淀物，振荡时呈均匀混浊。以－标记。

药敏试验管及对照管经（35±2）℃培养18h后，在试验对照管符合标准的情况下，根据各药敏试验管中肉汤的透明度、混浊度、管底沉淀物的性状，分别与对照管标准进行比较，得出待检样品中细菌对各种兽药的敏感程度，分别确定＋＋＋＋为高度敏感，＋＋＋为敏感，＋＋为中度敏感，＋为低度敏感，－不敏感。

2 结果与分析

2.1 药敏情况

采用11种兽药分别对6个试验组的待检样品进行药敏试验。

有关试验芭敏情况的详细结果列于表1。

表1 各试验组别的药敏情况

2.2 临床疗效

试验组1前期已饲喂SMM-TMP5d，故不选用，病重者选用复方氨苄西林肌注1～2次·d－1，3mg·kg－1，连用3d；轻者选用10%恩诺沙星，0.15mL·kg－1，必要时第3天再注射1次。经5d治疗，出现猪伪狂犬病症状，全群紧急免疫，3d后逐渐康复。

试验组2选用最敏感药物头孢噻呋钠肌注，3 mg·kg－1，1次·d－1，连用3～5d。

试验组3猪群病情较重，硫酸粘菌素毒性大，故选用中度敏感药物头孢噻呋钠，3mg·kg－1，1次·d－1，连用3～5d。

试验组4对咳嗽严重的选用替米考星，0.15 mL·kg－1，1次·d－1，连用3d，轻者用10%恩诺沙星，0.15mL·kg－1，或3d再打1次。

试验组5选用头孢噻呋钠，3mg·kg－1，1次·d－1，连用3～5d；添加10%恩诺沙星混料，连用5d。

试验组6及时选用硫酸庆大霉素，4mg· kg－1，1次·d－1，连用3～5d。

各试验组分别应用上述药物治疗的同时，饲料中添加多种维生素、氨基酸，增强机体抵抗力。经统计分析，药敏试验前后死亡率的变化呈极显著差异，取得了显著的防治效果（表2）。

表2 各试验组别的临床疗效

2.3 细菌耐药性

各试验组细菌耐药性的产生，与各猪场平时反复、不当使用抗菌药物有密切关系（表3）。从表1及表3显示，待检样品中细菌对试验兽药中度敏感以下占74%。

试验组1和5病菌对经常使用的头孢噻呋钠、替米考星、林可霉素为中敏以下，其他为敏感以上；试验组2，3和6长期滥用抗菌药物，分别只有1种兽药敏感以上；试验组4注重饲养管理，做好保健、防疫工作，不随意使用各类抗生素，大部分为敏感以上。

表3 各试验组别的细菌耐药性

3 小结与讨论

实验室诊断、分离病原细菌后，以纸片扩散法或肉汤稀释法进行常规药敏试验，由于操作复杂、检测时间较长，且误差率偏高，种种条件均限制常规药敏试验快速、高效检验［3－4］；而直接肉汤药敏试验一般不超过20h便可得出药敏结果。6组药敏试验管中，仅2对药敏试验管的误差大，忽略操作误差后准确率约＞97%。6组试验病猪群在选择敏感兽药治疗后，病死率大大下降，防治效果显著。试验方法操作简便、快速，重复性和稳定性高，具有较高的临床应用价值。

选择各类试验兽药，按临床治疗剂量配制试验兽药剂量，可以使体外药敏结果更接近临床疗效。有报道称，药敏结果和临床疗效两者符合率一般为70%～80%［5］，但通常药敏结果是选择抗菌药物的最重要科学依据。临床兽医根据药敏结果，结合前期兽药使用情况、多种病原菌感染、抗菌药物特性、药品价格、病畜状况等因素，确定首选的敏感兽药，进行及时有效防治。

总之，当规模猪场发生疫情，临床初步诊断是多重细菌性感染或混合感染时，采用直接肉汤药敏试验方法，快速确定药敏结果，合理使用首选敏感药物，可减少盲目用药和细菌耐药性的产生，有效控制临床并发症及死亡率，显著提高临床治疗效果。

［1］ 杨润德.当前猪病流行现状及防控［J］.今日畜牧兽医，2013（6）：11－12.

［2］ 施琛.直接药敏试验与常规药敏试验在临床血液细菌鉴定与检验中的应用价值研究［J］.临床合理用药，2013，6（40）：5－6.

［3］ 杨文祥，李新宇.营养肉汤培养法对鸡大肠杆菌的药敏试验［J］.上海畜牧兽医通讯，2009（1）：42－43.

［4］ 陈光宏，贺晓龙.猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定与药敏试验［J］.畜牧与兽医，2012，44（8）：70－71.

［5］ 贡联兵，魏晓敬，洪波，等.543株病原菌耐药分析［J］.中国医院药学杂志，2001，21（3）：37.

（责任编辑：卢福庄）

S854.5＋3

B

0528-9017（2014）08-1274-04

文献著录格式：刘跃生，潘陈苗，姚宁屏，等.直接肉汤药敏试验在猪病防治中的应用［J］.浙江农业科学，2014（8）：1274－1277.

2014-06-04

鸭坦布苏病毒及其抗体检测技术及流行病学研究（2012AY1063）

刘跃生（1963－），副教授，从事动物微生物教学及兽医临床工作。E-mail：1239811191＠qq.com。