稳定遗传的染色体组合整合酿酒酵母重组菌株的构建

左颀，赵心清，刘海军，胡世洋，马中义，白凤武

1 大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116023 2 中国石油天然气股份有限公司 吉林石化公司研究院，吉林 吉林 132021

酿酒酵母广泛应用于食品、酿造和燃料乙醇生产等领域，对其进行遗传育种研究一直是国内外研究的热点。染色体整合表达可实现基因工程菌的稳定遗传。目前利用同源重组构建稳定表达的酿酒酵母菌株已被广泛研究，选取的整合位点包括rDNA位点[1]和 δ-序列位点[2]等多拷贝整合位点，以及URA3[3]、HO[4]位点等单拷贝整合位点。对β-半乳糖苷酶报告基因在酿酒酵母染色体上多个位点整合结果的研究表明，lacZ基因在不同位点整合后，酶活差异可达到8.7倍[5]，推测可能存在位置效应，即由于染色体组蛋白甲基化等表观遗传学效应导致基因在染色体的不同位置表达水平不同[6-7]。

随着代谢工程的不断发展，微生物的遗传改造常需要对多个基因进行操作，在多基因整合时受抗生素和营养缺陷型选择标记种类的限制。Cre/loxP和 FLP/FRT重组系统因其可去除抗生素标记基因而被广泛应用于菌株的同源重组[8-9]。虽然这两个系统有着非常高效的重组效率，但是重组酶识别位点loxP和FRT序列仍然留在基因组上，可能会引发新的同源重组[9]。因此，选择可以彻底去除抗生素标记基因，并且可多次循环使用的高效重组载体，对酵母菌的生物育种非常关键。在代谢途径中限速步骤往往由多个基因控制，因此代谢工程操作需要对多个基因的表达进行平衡调控。国外学者采用多基因启动子改组 (Multiple gene-promoter shuffling，MGPS) 方法[10]，将不同活性的启动子与关键酶基因进行组合，从而调控多基因表达水平的平衡。但研究多基因在染色体不同位点的组合整合对基因表达和代谢的影响还没有相关报道。

pAUR135载体是可以循环使用抗生素标记的载体，该载体带有GIN11M86基因，可在Gal10启动子和半乳糖诱导下过量表达，只保留经过同源重组的不带有任何外源序列的转化子，利用该载体可对酿酒酵母进行重复多次整合表达，但国内相关的研究目前还没有充分开展。酵母菌代谢工程改造常需要多个基因的操作，多基因的表达需要进行平衡匹配，才能达到较好的效果[11]。我们以木糖代谢途径改造为例，说明了染色体组合整合表达方法构建工业酿酒酵母菌的过程，该方法也可用于其他代谢途径基因的改造，所获得的工程菌株不带有任何外来基因和选择标记，可稳定遗传，为工业酿酒酵母的分子育种提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 菌种和培养基

XR和XDH基因供体为树干毕赤酵母Scheffersomyces stipitisJCM 10742 (日本 RIKEN BioResource Center)，XK基因供体为S288c (本实验室保存)。工业酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae6525为本实验室保存。克隆载体pUC18和酵母pAUR135载体购自大连宝生物公司。酿酒酵母培养使用YPD培养基。按照实验需要，加入终浓度为2.5 μg/mL金担子素 (aureobasidin A，简称Aba+) 进行酵母阳性克隆子筛选。

1.2 分子克隆所用酶及试剂盒

PCR所用 Phusion High-Fidelity DNA聚合酶和限制性内切酶购自NEB公司。T4 DNA连接酶购自Fermentas公司。DNA片段纯化与回收试剂盒购自Omega Bio-tek, Inc.。

1.3 基因克隆和载体构建

1.3.1 染色体组合整合木糖途径基因盒的扩增和构建

以S. cerevisiae6525 DNA作为模板扩增3个基因的上下游6个同源臂序列：12 up，12 down，20 up，20 down，21 up，21 down，具体引物序列见表1。

以PsXR基因为例构建整合质粒的流程如图1所示。根据引物两端所连接的酶切位点将所有片段依次连接，形成3个基因盒。将3个基因盒分别连接在pAUR135载体骨架上，获得表达单个基因的表达载体。

图1 基于质粒pAUR135的目标基因染色体整合表达示意图 (以PsXR构建为例；虚线代表同源区域，实线代表交换区域)Fig. 1 Schematic diagram of pAUR135-based combinational chromosomal integration (construction of PsXR gene was presented as an example). Dashed lines represent homologous arms and solid lines represent exchanged regions.

1.3.2 载体线性化和酿酒酵母转化

基因盒的线性化酶切位点分别为SpeⅠ和EcoRⅠ。利用电转方法将3个线性化的载体依次转入酿酒酵母中，从而获得染色体3个位点分别整合3个木糖代谢基因的染色体组合整合重组酵母菌株。

1.3.3 三个木糖基因的酶活测定

粗酶液的制备和酶活的检测方法参考Eliasson等的文章[12]。每个酶活实验都重复3次，以平均值作为酶活数据。

1.3.4 重组酿酒酵母乙醇发酵

重组菌株在YPD培养基以30 ℃、200 r/min进行限氧发酵。初始接种的OD600为2.0。发酵培养基为YP培养基 (蛋白胨2%，酵母提取物1%) 分别加入3种混合糖浓度：20 g/L木糖和40 g/L葡萄糖；25 g/L木糖和50 g/L葡萄糖；30 g/L木糖和60 g/L葡萄糖。木糖利用率计算方法为：利用率(%)=(初始木糖浓度–剩余木糖浓度)/初始木糖浓度。

2 结果与分析

2.1 基因盒各个片段的PCR扩增结果

所连接的同源臂20 up和20 down将PsXR定位为PRCdelta15位点，PsXDH定位于染色体YPRCtau3位点，ScXK基因定位于染色体YIRCdelta6位点[5]。另外PsXR和PsXDH基因分别连接PGK1启动子，ScXK基因连接ADH1启动子，3个基因全部使用CYC1终止子。

2.2 三个基因盒的构建及菌株稳定性

将各个组成片段通过双酶切连接在一起，构建完整的基因盒载体pAUR-PsXR、pAUR-PsXDH和pAUR-ScXK。然后利用内切酶进行载体的单酶切，鉴定片段大小后电转入工业酿酒酵母中，得到的重组木糖酵母菌传代 180次后仍保持相应性状，所转入的片段与传代前片段完全吻合，测序结果也相同，说明利用该方法构建的重组菌可以在工业育种生产中保持稳定遗传。

2.3 重组酿酒酵母木糖代谢途径基因的酶活水平比较

在构建的重组组合整合菌株中，XR在辅因子为NADPH时的酶活大于辅因子为NADH时的酶活。XDH的酶活水平仅为 XR酶活的 36%。XK的酶活水平最低，为XDH的77.8%。三个基因所用的启动子强度接近，而且 3个基因都是单拷贝整合，所以表达强度的差异主要来自整合位点的不同。与对照菌株中的3个酶活力相比，染色体组合整合菌株的XR和XDH酶活明显提高 (表2)。

表2 重组菌株的木糖代谢关键酶酶活比较Table 2 Comparison of enzyme activities in the recombinant strains

2.4 重组酿酒酵母混合糖发酵分析

将构建的染色体组合整合的木糖重组菌在含有葡萄糖和木糖的发酵培养基中进行限氧发酵。与对照重组菌株相比，染色体组合整合的重组菌株的木糖利用率提高了24.4%–35.5% (表3)。发酵结果表明，染色体组合整合表达的基因可以成功实现酵母菌株发酵性能的优化 (葡萄糖数据未列出)。

表3 重组菌株的木糖利用率比较Table 3 Xylose utilization rate in the recombinant strains

3 结论与展望

利用pAUR135酵母整合表达载体，成功构建了染色体多位点组合整合的酵母菌株，所获得的菌株可稳定遗传。构建基于pAUR135的整合表达载体，通过改换不同强度启动子，增加基因拷贝数，变换染色体整合位点等手段实现基因表达量的组合控制，从而可实现多基因表达的平衡。文中提供的载体构建方式可以方便应用于工业酿酒酵母，是工业酵母菌育种的一种新方法。

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