毕赤酵母表达gp96-scFv抗体及生物活性测定

桂明明，武慧英，孙璐，徐亚星，赵报，李鑫，李长菲，王希东，孟颂东

1 新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052 2中国科学院微生物研究所 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101 3中国科学院大学，北京 100049

gp96是存在于真核生物细胞内质网中分子量约为96 kDa的热休克蛋白 (又称GRP94)[1]。它属于HSP90家族，是胞质HSP90的旁系同源蛋白，约占细胞总蛋白的1%，在细胞各种代谢功能中都起着重要的作用[2]。gp96具有结合多肽的能力，因而在抗原加工、呈递中发挥重要作用。内源性或外源性抗原进入细胞后被细胞中蛋白酶体降解，通过TAP分子进入内质网，进而与MHC (主要组织相容性复合物)Ⅰ类或Ⅱ类分子结合，供CD8+T细胞或CD4+T细胞识别[3]。研究表明gp96能结合进入内质网中的抗原肽并将结合的抗原呈递给 MHCⅠ类或Ⅱ类分子，在 T细胞识别抗原的过程中发挥着重要作用[4-6]。gp96作为一种重要的热休克蛋白，与多种疾病及肿瘤的发生相关[7-8]。因此，获得特异性结合gp96的抗体检测gp96的表达，同时作为靶向 gp96治疗来抑制有关疾病和肿瘤的发生[9-11]，具有很重要的意义。

目前市场上已有的gp96抗体大都是兔源、鼠源的单克隆或多克隆抗体。而腹水法生产的单抗或多抗往往含有较多的宿主性成分，应用于临床特别是体内治疗时可能引起一些麻烦(例如引起患者不适)，此外腹水法自身也无法满足工业、医药卫生及科研领域对抗体日益增长的需求。由于各种原因，研究者纷纷开展新型抗体研究来满足对抗体的日益需求[12]。新型小分子抗体单链可变区片段 (scFv) 是由一弹性接头 (Linker) 将VH和VL连接而成的两个可变区首尾相接的单一肽链，通过正确折叠，两个可变区由非共价键形成具有抗原结合功能的Fv段，此单一肽链的结构既有利于表达和进行基因重组操作，又增加了Fv的稳定性[13]。scFv抗体具有抗原结合部位的最小功能结构单位。以分子量小、体内半衰期短、免疫原性低、易于基因工程操作等特点而倍受关注[14]。已经有文献报道利用原核表达系统获得了鼠源的scFv[15]和Fab[16]小分子抗体。与原核表达系统相比，真核表达系统具有遗传操作方便、培养基成分简明和适合高密度发酵等优点；真核表达系统毕赤酵母具有分泌表达和二硫键加工等翻译后修饰的能力。因此许多在大肠杆菌中难以表达的重组蛋白在毕赤酵母中得以成功表达。另外，由于毕赤酵母遗传性状稳定、生产成本较低、蛋白表达量高，因此其在生物制药业中受到越来越多的关注[17-18]。文中通过构建毕赤酵母scFv抗体pPICZα-A表达质粒进行分泌表达，获得与 gp96特异性结合的 scFv小分子抗体，为gp96蛋白的功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体菌株、细胞株

毕赤酵母菌株X33及表达质粒pPICZα-A购自 Invitrogene公司 (美国)；大肠杆菌 DH5α、293T细胞系、人乳腺癌细胞SK-BR-3、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2细胞为本实验室保存。

1.1.2 试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker为TaKaRa公司产品；博莱霉素 (Zeocin)购自 Invitrogene公司 (美国)；分子量蛋白marker、PVDF膜购自 Promega公司；小鼠抗His-Tag mAb、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗小鼠 IgG-FITC为北京中杉金桥公司产品；Anti-His- HRP为Santa Cruze Biotech产品；gp96兔多克隆抗体为Enzo产品；DMEM、1640细胞培养基和胎牛血清购自 Gibco公司；质粒胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自北京康为世纪公司；Anti-His-tag亲和层析柱(His-Trap HP)为GE公司产品。

1.1.3 PCR引物

根据gp96-scFv抗体片段序列设计引物：上游 引 物 (5′-CGGAATTCCAGGTGCAGCTGGT GCAG-3′)，引入EcoRⅠ酶切位点；下游引物(5′-CGTCTAGATGAGTGGTGGTGGTGGTGAC C-3′)，引入XbalⅠ酶切位点和His标签。

1.2 方法

1.2.1 gp96-scFv基因的设计及合成

根据 gp96-scFv的基因序列 (GenBank Accession No. AJ252276.1)[19]，委托上海生工生物工程技术服务公司合成该基因。

1.2.2 pPICZα-gp96-scFv重组表达载体的构建

以合成的gp96-scFv基因序列为模板设计引物，利用TaqDNA聚合酶进行常规扩增反应，将扩增产物和pPICZα-A质粒分别用EcoRⅠ和XbalⅠ双酶切，回收、连接，获得 pPICZαgp96-scFv重组表达载体，并对其进行酶切和测序鉴定。

1.2.3 酵母菌转化、筛选及鉴定

将上述重组质粒和空载体pPICZα-A分别用SacⅠ单酶切，用Bio-Rad电转仪 (270 V，11 ms)将线性化后的质粒分别转化至毕赤酵母株 X33中。取转化菌涂布于含有 100 mg/L Zeocin的YPDS平板上，于28–30 ℃温箱中培养2–3 d。将抗性筛选转化子梯度接于含 500、800、1 000 mg/ L Zeocin的YPDS固体培养基上，48 h左右观察转化子的生长情况。挑取1 000 mg/ L Zeocin平板中单菌落接种于5 mL YPD液体培养基中，28–30 ℃培养16–20 h。提取酵母菌基因组DNA，PCR鉴定目的基因是否整合成功。

1.2.4 甲醇诱导表达及鉴定

取阳性菌液接种于100 mL BMGY培养液中，于28–30 ℃培养至OD600值为2.0–6.0时，3 000 r/min离心5 min收集菌体，用适量体积的BMMY培养基重悬，使OD600值为1.0左右。加入甲醇溶液诱导表达使其终浓度维持在0.5%–1% (每24 h补加1次甲醇)，培养4 d分别在各诱导表达的时间点 (0、12、24、36、48、72、96 h) 各取1 mL发酵液，采用斑点杂交法对表达产物进行鉴定。

1.2.5 目的蛋白的纯化和鉴定

采用Anti-His-tag亲和层析柱 (His-Trap HP)对表达的scFv进行纯化，具体步骤见纯化试剂盒说明书。通过SDS-PAGE和Western blotting对纯化目的蛋白进行鉴定。

1.3 gp96-scFv抗体生物活性的测定

1.3.1 Western blotting方法评价gp96-scFv抗体对SK-BR-3细胞gp96蛋白的检测活性

将培养的 SK-BR-3细胞去培养基后，PBS洗2–3遍，加入500 μL预冷的细胞裂解液，置于冰上裂解1 h，收集细胞裂解液，12 000 r/min离心30 min，取上清，与SDS电泳上样缓冲液混匀后上样，SDS电泳3 h。然后，通过电转移系统将凝胶中分离的蛋白转印 (恒压 100 V，95 min) 到PVDF膜上。PVDF膜经含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h后，用终浓度为1 μg/mL的gp96-scFv抗体于4 ℃孵育过夜。PVDF膜经TBST漂洗后，置于含有 1 μg/mL的小鼠抗His-Tag抗体的TBST中，4 ℃孵育4 h。PVDF膜经TBST再次漂洗后，用1∶2 000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠抗体于室温孵育2 h。最后按Western blotting发光试剂盒的操作说明，将胶片曝光显影观察结果。

1.3.2 Flow cytometry方法评估gp96-scFv抗体对SK-BR-3细胞膜表面gp96的检测活性

SK-BR-3经0.5 mmol/L EDTA消化处理后，收集 1×106个细胞，PBS 洗两遍。用 200 μL PBS重悬细胞，加入纯化后的gp96-scFv抗体使其终浓度为100 μg/mL，轻轻混匀，4 ℃孵育1 h。用PBS洗两遍，以200 μL的PBS将细胞重悬，加入2 μL anti-His-FITC抗体，轻轻混匀，4 ℃避光孵育 30 min，再用 PBS洗两遍，最终用400 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪观察结果。

1.3.3 ELISA方法评估gp96-scFv抗体对gp96蛋白的检测活性

用于包被的 gp96蛋白从人胎盘中纯化提取[20]，用包被液 (25 mmol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6) 倍比稀释10 μg gp96蛋白，每孔100 μL，4 ℃包被过夜，用PBST洗涤3次 (PBST： 0.05%Tween-20的PBS，pH 7.4) 后，每孔加200 μL封闭液封闭 (封闭液：5% BSA)，置于37 ℃孵育1 h，每孔加入100 μL 1 μg/mL封闭液稀释的gp96-scFv抗体，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤3次后加入100 μL用封闭液稀释的anti-His-HRP(1∶100) 抗体，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤4次。每孔加入100 μL TMB底物液避光反应10 min后，每孔再加入 50 μL终止液 (2 mol/L硫酸)，5 min后读取450 nm处的吸光值 (OD450)。

1.3.4 Immunofluorescence方法评估gp96-scFv抗体对MCF-7细胞膜表面gp96的检测活性

将灭菌后的盖玻片放入 6孔板，每孔加入3×105的 MCF-7细胞，培养过夜。吸去 6孔板中的培养液，用PBS洗1次。加入5% BSA的PBS封闭液 37 ℃封闭 15 min。加入纯化后的gp96-scFv抗体使其终浓度为100 μg/mL，孵育1 h，PBS洗 3次。加入用封闭液稀释后的anti-His-FITC (1∶100) 抗体避光孵育1 h。PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定细胞10 min，吸去多聚甲醛固定液，PBS洗 3次。在载玻片上滴一滴封片剂，用镊子轻轻夹出盖玻片，用吸水纸将残留的液体吸干。最后用中性树胶封片，荧光显微镜观察结果。

2 结果

2.1 pPICZα-gp96-scFv重组表达载体的构建及鉴定

以合成gp96-scFv抗体序列为模板，PCR扩增该基因片段，结果在琼脂糖凝胶电泳上出现1条约 300 bp的 DNA条带，同预期结果相符(图 1A)。以EcoRⅠ和XbalⅠ双酶切的 PCR产物和pPICZα-A空载质粒连接后，再用双酶切鉴定，在琼脂糖凝胶电泳上出现2条分别约300 bp和 3.6 kb的 DNA条带 (图 1B)，与预期结果相符。

2.2 重组质粒转化的毕赤酵母菌Mut的鉴定

在含 500、800、1 000 mg/L不同梯度的Zeocin的YPDS固体培养基上抗性筛选毕赤酵母转化子，最后提取1 000 mg/L Zeocin毕赤酵母菌的基因组，PCR鉴定为阳性重组的毕赤酵母菌，PCR产物包含 pPICZα-A载体和 gp96-scFv基因片段，通过EcoRⅠ和XbalⅠ双酶切后在琼脂糖凝胶电泳上出现2条大小约是300 bp和3.6 kb的DNA条带，分别为pPICZα-A载体和 gp96-scFv基因片段，同预期分子量相符合(图 1C)。

图1 pPICZα-gp96-scFv重组表达载体的构建及鉴定Fig. 1 Construction and identification of pPICZα-gp96-scFv fragment recombinant plasmid. (A) The gp96-scFv fragment gene was produced by PCR from the pUC57 templates. M： DNA marker; 1–2： PCR products of gp96-scFv gene. (B) Identification of the recombinant vectors by enzyme digestion. M： DNA marker; 1： EcoR and ⅠXbalⅠdigested plasmid. (C) Identification of the Pichia pastoris colonies by PCR and enzyme digestion. M： DNA marker; 1–5： EcoRand ⅠXbalⅠdigested PCR products from positive Pichia pastoris colonies.

2.3 目的基因在毕赤酵母菌中的表达

将重组质粒转化的毕赤酵母菌加入甲醇诱导不同时间后的培养上清进行斑点杂交检测，结果显示以pPICZα-gp96-scFv重组质粒转化，各时间点毕赤酵母菌的培养上清在硝酸纤维素膜上均出现斑点，其中第72 h出现的斑点亮度最高；而空载体转化的毕赤酵母菌各时间点的培养上清在硝酸纤维素膜上均未出现斑点(图2A)。

2.4 目的蛋白的纯化和鉴定

采用Anti-His-tag亲和层析柱(His-Trap HP)对表达的gp96-scFv进行纯化，纯化的目的产物经 SDS-PAGE检测表明，考马斯亮蓝染色的丙烯酰胺凝胶出现2条分子量约为15 kDa的条带(图2B)。Western blotting鉴定的结果显示，纯化的目的蛋白在胶片上出现1条分子量为15 kDa的蛋白条带；而空载体转化的毕赤酵母菌发酵液作为阴性对照则没有相应的条带 (图2C)，并且条带位置同预期分子量大小基本相同。同时，将人胎盘中纯化的gp96蛋白进行SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色的丙烯酰胺凝胶出现1条分子量约为96 kDa的明显条带，再使用商业化的gp96兔多克隆抗体或gp96-scFv抗体对人胎盘gp96蛋白和牛血清白蛋白 (BSA) 作为阴性对照进行Western blotting杂交，Western blotting结果显示均能出现明显杂交条带 (图2D)，结果表明纯化的蛋白是96-scFv抗体，且能够结合 gp96蛋白。

2.5 gp96-scFv抗体生物活性检测

2.5.1 gp96-scFv抗体的Western blotting检测

SK-BR-3细胞经细胞裂解液处理后，分别取0、20、30 μg细胞裂解液上清进行SDS-PAGE。转膜以后将 PVDF膜与 1 μg/mL纯化后的gp96-scFv抗体4 ℃孵育过夜。最后按Western blotting发光试剂盒的操作说明，将胶片爆光显影观察结果。结果显示，在胶片上出现 1条分子量约为96 kDa的蛋白条带；而阴性对照则无此条带 (图3A)。同时，将野生型HepG2细胞和siRNA稳定敲低gp96的HepG2细胞经细胞裂解液处理后，分别取 30 μg上清蛋白进行 Western blotting，结果显示 siRNA稳定敲低 gp96细胞相对于野生型细胞条带明显变弱 (图3A下)，这些结果均表明96-scFv抗体能够特异结合gp96蛋白。

图3 gp96-scFv抗体生物活性检测Fig. 3 Detection of the biological activities of gp96-scFv antibody. (A) Western blotting detection of endogenous gp96 in SK-BR-3 cells (up), and HepG2 cells or HepG2 cells stably transfected with gp96 RNAi (down) using gp96-scFv antibody. (up) lane 1： PBS as a negative control; 2–3： different amounts of SK-BR-3 cells lysates. (down)1： HepG2 cells lysates; 2： cell lysates of HepG2 cells stably transfected with gp96 siRNA. (B) FACS analysis of cell surface gp96 in SK-BR-3 cells using gp96-scFv antibody. Mouse control IgG serves as a negative control. gp96 Rabbit polyclonal antibody serves as a positive control. (C) ELISA analysis of gp96-scFv antibody. gp96 Rabbit polyclonal antibody serves as a positive control. (D) Immunofluorescence staining of unpermeabilized MCF-7 cells and 293T cells (as a negative control) using gp96-scFv antibody. Bar=30 μm.

2.5.2 gp96-scFv抗体的Flow cytometry检测

用EDTA处理SK-BR-3细胞后，分别向细胞中加入1∶100 gp96 兔多克隆抗体和100 μg/mL表达纯化的96-scFv抗体，其中gp96 兔多克隆抗体处理组为阳性对照组，不加96抗体为阴性对照组。孵育后分别加入FITC标记的荧光二抗，流式细胞仪结果显示阳性对照和纯化96-scFv抗体处理的都出现峰明显的偏移 (图3B)。Flow cytometry结果表明gp96-scFv抗体能够结合细胞膜表面gp96。

2.5.3 gp96-scFv抗体的ELISA检测

将纯化的gp96蛋白10 μg依次梯减倍比稀释包被，用1 μg/mL纯化后的gp96-scFv抗体，同时加入1∶1 000 gp96兔多克隆抗体处理组为阳性对照组，经Anti-His-HRP二抗孵育显色后在 450 nm 读取的吸光值 (OD450) (图 3C)gp96-scFv抗体检测的 gp96蛋白最低浓度为50 pg/μL。ELISA结果表明重组表达gp96-scFv抗体具有比商业化gp96兔多克隆抗体 (Enzo产品) 有更强的灵敏度和亲和力。

2.5.4 gp96-scFv抗体的 Immunofluorescence检测

3 讨论

本研究构建了重组载体pPICZα-gp96-scFv，使用毕赤酵母表达系统表达目的蛋白gp96-scFv抗体片段，且获得具有较高亲和力和特异性的抗 gp96蛋白的分泌型 scFv小分子抗体[21-22]。在毕赤酵母表达的目的蛋白 gp96-scFv抗体筛选体系中不仅限于传统的PCR、RT-PCR及分子杂交等方法筛选，而且利用毕赤酵母其强大的分泌功能对蛋白直接筛选鉴定，本研究筛选多拷贝整合转化子是参照了Schagger等[23]的斑点杂交方法，由于本研究中工程菌gp96-scFv基因的密码子是毕赤酵母利用频率最高的密码子，同时工程菌是通过斑点杂交筛选的拷贝数较高的转化子，因此该毕赤酵母菌具有能高效分泌表达的能力。

毕赤酵母表达目的蛋白 gp96-scFv抗体片段通过在C端连接His标签是为了方便纯化和鉴定，采用Anti-His-tag亲和层析柱 (His-Trap HP) 对表达的 gp96-scFv进行纯化的方法，能保持蛋白的生物活性，操作简单、经济，而且可重复使用[24]。通过 Anti-His-tag亲和层析柱纯化目的蛋白的纯度能达到 95%，在经过截留相对分子质量为10 kDa膜进行超滤浓缩，浓缩后的目的蛋白纯度效果更好。本研究中的目的蛋白在电泳SDS-PAGE图中的条带大小位置与预期蛋白的分子量大小接近，并通过 Western blotting鉴定了目的蛋白。并对纯化的目的蛋白通过 Western blotting、Flow cytometry、Immunofluorescence等分析方法鉴定其生物活性，结果表明gp96-scFv抗体是具有较高亲和力和特异性抗 gp96蛋白的 scFv小分子抗体，ELISA试验分析发现表达的 gp96-scFv抗体对gp96蛋白检测的灵敏度和亲和力高于市售的商业化抗体。

利用毕赤酵母可大量和相对廉价地表达scFv抗体片段，用于 Western blotting、Immunofluorescence、ELISA和Flow cytometry检测gp96蛋白。scFv抗体片段的最大优点是能增强荧光激活细胞分类筛选(Fluorescenceactivated cell sorting, FACS) 和ELISA检测等许多免疫化学应用中的灵敏性和效率[25]；其次，scFv片段一般设计某种形式的“标签”(如组氨酸或 E-tag标签) 可用于快速检测和纯化 gp96蛋白分子；此外，相对于传统抗体，由于 scFv抗体分子小，有较强穿透能力，适合于肿瘤的检测和靶向治疗[26-27]。因此scFv片段抗体能够广泛地应用于临床检测、治疗和免疫化学等

领域[28-30]。

[1]Wu S, Hong F, Gewirth D, et al. The molecular chaperone gp96/GRP94 interacts with Toll-like receptors and integrins via its C-terminal hydrophobic domain. J Biol Chem, 2012, 287(9)：6735–6742.

[2]Lindquist S, Craig EA. The heat-shock proteins.Annu Rev Genet, 1988, 22： 631–677.

[3]Wang SF, Qiu LP, Liu GZ, et al. Heat shock protein gp96 enhances humoral and T cell responses, decreases Treg frequency and potentiates the anti-HBV activity in BALB/c and transgenic mice. Vaccine, 2011, 29： 6342–6351.

[4]Xu YX, Wang SF, Zhang XJ, et al. Immune activity of heat shock protein gp96 and its application in active immunotherapy for tumor and infectious diseases. Chin J Biotech, 2012, 28(3)： 261–266 (in Chinese).

徐亚星, 王赛锋, 张小俊, 等. 热激蛋白 gp96免疫学功能及在主动免疫治疗肿瘤及传染病中的应用. 生物工程学报, 2012, 28(3)： 261–266.

[5]Srivastava PK, Udono H, Blachere NE, et al. Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming. Immunogenetics,1994, 39(2)： 93–98.

[6]Matsutake T, Sawamura T, Srivastava PK. High efficiency CD91-and LOX-1- mediated re-presentation of gp96-chaperoned peptides by MHC II molecules. Cancer Immunity, 2010, 10： 7.

[7]Han JM, Kwon NH, Lee JY, et al. Identification of gp96 as a novel target for treatment of autoimmune disease in mice. PLoS ONE, 2010, 5(3)： e9792.

[8]Chavany C1, Mimnaugh E, Miller P, et al.p185erbB2 binds to GRP94in vivo. Dissociation of the p185erbB2/GRP94 heterocomplex by benzoquinone ansamycins precedes depletion of p185erbB2. J Biol Chem, 1996, 271(9)：4974–4977.

[9]Melendez K, Wallen ES, Edwards BS, et al. Heat shock protein 70 and glycoprotein 96 are differentially expressed on the surface of malignant and nonmalignant breast cells. Cell Stress Chaperones, 2006, 11(4)： 334–342.

[10]Ciocca DR, Cuello-Carrión FD, Natoli AL, et al.Absence of caveolin-1 alters heat shock protein expression in spontaneous mammary tumors driven by Her-2/neu expression. Histochem Cell Biol,2012, 137(2)： 187–194.

[11]Li J, Richter K, Buchner J. Mixed Hsp90-cochaperone complexes are important for the progression of the reaction cycle. Nat Struct Mol Biol, 2011, 18： 614–617.

[12]Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.1975. J Immunol, 2005, 174(5)： 2453–2455.

[13]Arndt KM, Müller KM, Plückthun A. Factors influencing the dimer to monomer transition of an antibody single-chain Fv fragment. Biochemistry,1998, 37(37)： 12918–12926.

[14]Biocca S, Ruberti F, Tafani M, et al. Redox state of single chain Fv fragments targeted to the endoplasmic reticulum, cytosol and mitochondria.Biotechnology, 1995, 13(10)： 1110–1115.

[15]Muller BH, Lafay F, Demangel C, et al. Phagedisplayed and soluble mouse scFv fragments neutralizerabies virus. J Virol Methods, 1997,67(2)： 221–233.

[16]Ando T, Yamashiro T, Takita-Sonoda Y, et al.Construction of human Fab library and isolation of monoclonal Fabs with rabies virus-neutralizing ability. Microbiol Immunol, 2005, 49(4)： 311–322.

[17]Guo Y, Kang W, Zhong Y, et al. Purification and characterization of human IL-10/Fc fusion protein expressed inPichia pastoris. Protein Expr Purif,2012, 83(2)： 152–156.

[18]Li Y, Song HL, Li J, et al. Hansenula polymorpha expressed heat shock protein gp96 exerts potent T cell activation activity as an adjuvant. J Biotechnol,2011, 151： 343–349.

[19]Arnold-Schild D, Kleist C, Welschof M, et al.One-step single-chain Fv recombinant antibody-based purification of gp96 for vaccine development. Cancer Res, 2000, 66(15)：4175–4178.

[20]Zhao B, Wang YZ, Wu B, et al. Placenta-derived gp96 as a multivalent prophylactic cancer vaccine.Sci Rep, 2013, 3： 1947.

[21]Hartner FS, Glieder A. Regulation of methanol utilization pathway genes in yeasts. Microb Cell Fact, 2006, 5： 39.

[22]Shapiro RI, Wen D, Levesque M, et al. Expression of sonic hedgehog-Fc fusion protein inPichia pastoris. Identification and control of posttranslational, chemical, and proteolytic modifications.Protein Expr Purif, 2003, 29(2)： 272–283.

[23]Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodiumdodecyl sulfate polyacrylamid gel electropores is for the separationof proteins in the range from1 to 100 kDa.Anal Biochem, 1987, 166(2)： 368–379.

[24]Hou X, Liu JE, Hu TM. Prokaryotic expression of functional PTEN inEscherichia coliand preparation of polyclonal antibody. Chin J Biotech,2006, 22(1)： 58–64 (in Chinese).

侯鑫, 刘俊娥, 扈廷茂. 抑癌蛋白 PTEN 的原核表达、抑癌活性研究和抗体制备. 生物工程学报,2006, 22(1)： 58–64.

[25]Wang T, Duan Y. Probing the stability-limiting regions of an antibody single-chain variable fragment： a molecular dynamics simulation study.Protein Eng Des Sel, 2011, 24(9)： 649–657.

[26]Liu D, Wang C, Li C, et al. Production and characterization of a humanized single-chain antibody against human integrin alphav beta3 protein. J Biol Chem, 2011, 286(27)： 24500–24507.

[27]Robert R, Wark KL. Engineered antibody approaches for Alzheimer's disease immunotherapy. Arch Biochem Biophys, 2012,526(2)： 132–138.

[28]Ma Q, De Marte L, Wang Y, et al.Carcinoembryonic antigen-immunoglobulinFc fusionprotein (CEA-Fc) for identification and activation of anti-CEA immunoglobulin-T-cell receptor-modified T cells, representative of anewclass of Ig fusion proteins. Cancer Gene Ther,2004, 11(4)： 297–306.

[29]Wagner B, Robeson J, McCracken M, et al. Horse cytokine/IgG fusion proteins-mammalian expression of biologically active cytokines and a system to verify antibody specificity to equine cytokines. Vet Immunol Immunopathol, 2005,105(1/2)： 1–14.

[30]Liu J, Wei D, Qian F, et al. pPIC9-Fc： a vector system for the production of single-chain Fv-Fc fusions inPichia pastorisas detection reagentsin vitro. J Biochem, 2003, 134(6)： 911–919.