酿酒酵母乙酸耐性分子机制的功能基因组进展

赵心清，张明明，徐桂红，许建韧，白凤武

大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024

酿酒酵母广泛应用于食品、酿造及生物能源生产等不同领域，良好的细胞活性有利于增加生物量的积累，促进细胞循环使用，提高发酵效率，但酿酒酵母在生长和发酵过程中，尤其是在工业生产条件下，经常受到高浓度乙醇、极端温度 (冷冻或高温等)、低pH及高渗透压等环境胁迫因素的影响，这些环境胁迫条件抑制细胞生长及代谢，从而影响了生产效率。因此，酿酒酵母细胞对环境胁迫因素的反应和耐受性机制一直是国内外学者研究的重点[1-5]。

燃料乙醇是目前广泛生产使用的可再生清洁能源，以来源丰富、价格低廉的纤维素原料生产燃料乙醇已成为国内外研究的热点，但目前限制燃料乙醇大规模生产的关键问题是成本过高。在纤维素乙醇生产中，原料预处理过程中产生的弱酸类﹑醛类和酚类等抑制物对细胞的生长和发酵具有抑制作用，这些抑制物中，弱酸类化合物中的乙酸含量最高。乙酸由木质纤维素预处理过程中木糖脱乙酰作用生成，在纤维素原料水解液中的浓度受所使用的生物质种类及预处理技术的影响而不同，但浓度大约在1–10 g/L[6]。酿酒酵母不同菌株对乙酸的耐受性不同，如当乙酸浓度大于2 g/L时，木糖共发酵重组酵母6508-127的木糖利用率和生物量积累受到明显影响，乙酸浓度为10 g/L时，酵母细胞停止利用木糖和生长，而絮凝酵母SPSC01可在15 g/L乙酸中生长和发酵[5,7]。作为纤维素原料水解液中主要的毒性副产物，乙酸对酵母细胞的生长和乙醇发酵具有强抑制作用，但长期以来对乙酸如何产生毒性，酵母细胞如何响应乙酸胁迫，以及如何调整代谢抵抗乙酸的毒性了解得还不够深入。与纤维素水解液中的其他抑制物相比，乙酸对细胞全局基因转录的影响要大很多，如当细胞在分别含有乙酸、糠醛和羟甲基糠醛等抑制物质的培养基中生长的时候，转录组分析结果表明[8]，有150个基因在乙酸影响下表达出现显著变化，其中 120个是特异响应乙酸的，含有72个上调基因，而在含有糠醛和羟甲基糠醛的培养基中，分别只有27个和31个基因的表达出现明显变化。因此，乙酸耐性分子机制的功能基因组研究引起了普遍关注。

近年来，国内外学者对在毒性水平的乙酸作用条件下酿酒酵母细胞的适应性反应及耐受性的分子机理进行了深入研究，利用细胞全局转录分析、蛋白组学分析及单基因敲除突变体文库表型组等手段，发现了很多新的与酵母菌乙酸耐性相关的基因，本文着重介绍近年来酵母菌乙酸耐性的功能基因组研究进展。

1 乙酸毒性的分子机制

胞内环境酸化是乙酸抑制细胞生长的主要原因。当培养基的 pH值低于乙酸的解离常数(pKa 4.76) 时，分子态的乙酸可通过自由扩散或水甘油通道蛋白Fps1p以及转运蛋白Ady2p和Jen1p转运入细胞内[9-11]，从而导致胞内酸化，因此乙酸毒性与细胞生长的环境pH有关。研究在pH值分别为 5、5.5和6时不同浓度的乙酸对酵母葡萄糖和木糖共发酵的影响，发现随着pH值的增加，乙酸对葡萄糖和木糖利用的抑制得到明显的缓解；如在15 g/L乙酸条件下，pH为5时，60 g/L葡萄糖需要60 h才被消耗完，而在 pH为6时只需12 h完成发酵[12]，因此调节pH值可以缓解乙酸对酵母的毒害作用。但是酵母生长和发酵的最适pH值偏酸性，而且当培养基中存在高浓度乙酸时不可能通过加入大量的碱来调节其pH值，提高发酵菌株的乙酸耐受性，可保证酵母细胞在乙酸浓度较高的条件下具有较好的细胞活性。

利用约5 000多个BY4741宿主背景的酿酒酵母菌单基因敲除突变体文库研究与乙酸耐性相关的基因，发现有 650个基因与乙酸响应相关[13]。酵母细胞对乙酸的响应及乙酸的毒性机制见图 1，包括与乙酸转运、胞内酸化后胞内pH维持、细胞壁重构、转录因子对细胞代谢的全局调控、氧化胁迫反应以及金属离子对乙酸耐性的作用等[11,13-18]。本文将分别就这些过程相关的功能基因组研究进行综述。

1.1 细胞壁相关蛋白与乙酸耐性

利用酿酒酵母 BY4741宿主来源的单基因敲除的突变体，通过考察其在含乙酸平板上的生长情况，鉴别了多个与细胞壁功能相关的基因[13]，其功能可能与乙酸胁迫条件下细胞的生长有关，这些基因的功能包括合成细胞壁组分的基因，如MNN2、MNN9、FKS1、ROT2，与细胞壁合成调控作用相关的基因，如ROM2，以及功能未知但敲除后影响出芽的基因，如BEM4等。细胞壁葡聚糖酶基因EGT2和SCW11分别与分裂后的细胞分离和有性生殖中细胞结合有关，其敲除后乙酸和乳酸的耐性均得到提高[18]，此外，细胞壁功能相关的基因SED1和SPI1都编码与胁迫反应相关的细胞壁蛋白，SPI1的敲除可导致细胞在乙酸中的生长受到抑制[19]，并发现该基因受转录因子Haa1p和Msn2p的调控[20]，但SED1敲除后，只提高了乳酸的耐受性，说明不同有机酸对细胞的毒性和细胞的反应存在一定差异。推测乙酸胁迫条件下细胞壁出现重构，因此与细胞壁合成相关的基因及一些细胞壁结构蛋白的合成发生变化。细胞壁的合成能减少多孔的结构，因此通过细胞壁的重构 (Cell wall remodeling) 阻止乙酸通过扩散进入细胞，从而减少乙酸的毒性。

1.2 膜蛋白及膜磷脂合成相关基因与乙酸耐性

细胞膜蛋白中与乙酸耐性相关的包括乙酸转运相关的蛋白 (如Fps1p)，以及功能与质子转运偶联的其他膜转运蛋白。酿酒酵母通过膜质ATP酶维持胞内pH的稳定，也通过细胞壁和细胞膜的重构 (Membrane reconfiguration) 降低对分子态乙酸的吸收和防止乙酸对膜的损伤。为维持质膜电位、防止胞内酸化，细胞膜上的腺苷三磷酸酶 H+-ATPase (PMA1基因编码) 可水解ATP产生能量，将质子泵出细胞来维持细胞内正常的中性环境。因此在弱酸存在时，必须有足够的能量供细胞利用，但是在高浓度乙酸存在时，ATP消耗过多导致缺乏，细胞内的质子不能完全被泵出，从而引起胞内酸化，抑制细胞生长和代谢[16]。

图1 酿酒酵母中乙酸胁迫的反应机制Fig. 1 Mechanisms of acetic acid stress response in S. cerevisiae cells.

细胞对乙酸毒性的很重要的反应是阻止乙酸进入细胞。细胞可通过瞬时激活Hog1p蛋白激酶，将质膜水甘油通道蛋白 Fps1p磷酸化并发生内吞，因此减少乙酸通过这个孔蛋白的扩散进入[21]。敲除 Fps1p编码基因可提高酿酒酵母乙酸耐性，并提高乙醇产率[22]。

日本学者对一株耐乙酸的酿酒酵母菌ATCC 38555进行全基因组转录分析发现，与不耐受乙酸的菌株相比，乙酸冲击条件下 ATCC 38555菌株的TOP2转录上调更明显，是对照菌提高倍数的 3倍，提示该膜转运蛋白可能与乙酸耐性有关。TOP2编码多胺转运蛋白，其对物质的转运与质子的转运偶联，已有报道表明，TOP2敲除后菌株的乙酸耐性下降，而该蛋白是与乙酸适应相关的重要调节蛋白 Haa1p的下游调控蛋白，但该蛋白在乙酸耐性中的具体作用还不清楚[23]。

由于细胞膜的成分在细胞胁迫反应中具有重要作用，而细胞膜中磷脂的组成和比例对膜的特性具有重要影响[24]。研究者对乙酸、糠醛和酚类物质联合处理条件下细胞膜磷脂的成分和相关基因转录进行了研究，发现对混合抑制物具有良好耐受性的 T菌株具有较长的磷脂脂肪酸链，亲本菌株耐性不好的 P菌株中多个编码脂肪酸延长酶和脂肪酸合成酶的基因，包括FEN1、SUR4、FAS1和FAS2在混合抑制物中生长后表达出现下调，但在耐性好的 T菌株中除了FEN1基因外没有明显下调，而且FEN1在T菌株中的下调也不如P菌株明显。此外，T菌株同时具有较低的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS) 含量和较慢的PS向磷酯酰乙醇胺 (Phosphatidylethanolamine, PE) 转化的效率，作者发现编码PS合成酶的CHO1基因在耐性较好的菌株中受抑制物冲击后表达下调，而亲本菌株耐性不好的P菌株CHO1基因在受抑制物冲击后表达上调。磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine, PC) 由 PE经过甲基化后合成，在该研究中还发现，耐性好的 T突变株具有较低的 PE/PC的比例，与此相应的，T菌株具有较高的CHO2基因转录水平，该基因编码一个关键的PE甲基化酶[25]。

1.3 能量代谢相关基因与乙酸耐性

细胞的能量主要来自糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化，由于膜质ATP酶和液泡ATP酶泵出质子抵抗胞内酸化需要消耗能量，所以能量代谢与乙酸耐性密切相关。利用单基因敲除的突变体文库进行乙酸耐性相关基因的筛选发现，敲除HXK2、PFK1、LPD1、PYC1、ATP1和COX9等和能量代谢相关的基因后，细胞在含有4.2–5.4 g/L乙酸的平板上生长受到严重抑制甚至无法生长[13]。日本学者对耐乙酸的酿酒酵母菌ATCC 38555在6 g/L乙酸处理30 min后的全局基因转录进行分析结果表明，与能量代谢相关的很多基因，包括ATP15、ATP17、ATP18、COX7、COX9、COX12和COX13等表达明显上调，而乙酸耐性不强的酵母菌在同样的乙酸冲击条件下未发现这些基因表达的明显变化，显示了耐性菌快速调节能量代谢相关基因是其对乙酸的耐性提高的一个原因[23]。

我国天津大学学者对工业酵母在含 18 g/L乙酸的培养基中培养20 min后转录组分析的结果中，揭示了高浓度乙酸冲击条件下，与呼吸作用相关的细胞色素C氧化还原酶基因COR1、COX11、PET309、COX20和CBP4表达明显下调，同时，线粒体 ATP酶基因ATP4和与能量产生有关的线粒体无机焦磷酸酶基因PPA2的表达也受到明显抑制，另外，负责糖原代谢和海藻糖代谢的基因表达也出现下调，表明高浓度乙酸冲击对能量储存、电子传递、以及 ATP再生具有一定影响。作者还发现很多线粒体核糖体蛋白编码基因的转录出现明显下调，表明高浓度乙酸对线粒体的功能具有重要影响作用[26]。对乙酸糠醛等胁迫抑制化合物具有良好耐性的菌株及亲本菌株在乙酸糠醛酚类同时存在条件下进行比较蛋白组分析，发现糖酵解途径关键酶Eno1p、Fba1p和Adh1p等在耐性菌株和敏感菌株中均上调，但在敏感菌中上调更明显，说明敏感菌需产生更多的能量抵抗抑制剂的毒害作用[27]。

1.4 氨基酸合成及蛋白代谢与乙酸耐性

氨基酸代谢对细胞的生长和正常代谢至关重要。细胞在乙酸毒性作用下氨基酸的合成可能受到抑制，蛋白折叠和蛋白降解也受到影响，因此氨基酸合成和蛋白代谢基因的功能与乙酸耐性相关。对酵母菌单基因敲除突变体在乙酸平板上的生长比较结果表明，参与甲硫氨酸和半胱氨酸合成的基因MET4和CYS3，参与组氨酸合成的HIS4，参与甘氨酸合成相关的GLY1和谷氨酰胺合成的GDH1基因破坏后，细胞在乙酸平板上的生长受到影响[13]。前期研究还发现，高浓度乙酸冲击可引起细胞内精氨酸、组氨酸和色氨酸合成基因的上调[26]，说明氨基酸合成与乙酸毒性的反应密切相关。进一步的研究表明，氨基酸代谢的变化不仅仅与氨基酸合成蛋白有关，也与蛋白降解有关[27]。在添加含有乙酸的混合抑制剂的处理后，与蛋白折叠和蛋白降解相关的很多蛋白表达均出现上调，其中变化较明显的包括Hsp60p、Dka1p和20S蛋白酶体Pre8p以及Pre1p等，因此作者推测，在乙酸等抑制物的存在条件下，细胞产生氧化胁迫，因此造成蛋白变性，而蛋白折叠和降解相关的蛋白表达，有助于细胞恢复正常的生理代谢功能。

1.5 与乙酸耐性相关的金属代谢

许多金属离子是细胞中多种酶的辅酶，其吸收和在细胞内的移动影响细胞代谢。利用酵母菌单基因敲除突变体研究乙酸耐性相关基因时发现[13]，个别金属离子代谢相关基因与乙酸耐性有关。与钾离子吸收相关的基因有TRK1和ARL1，前者是钾离子转运蛋白，后者作为GTPase调控钾离子的内流。TRK1敲除后的菌株在4.2 g/L乙酸平板上完全不能生长，而ARL1敲除后细胞可有微弱生长。培养基中添加0.01 mol/L和0.02 mol/L的氯化钾可明显缓解2.4 g/L乙酸对细胞的毒性。添加钾离子能提高酵母的乙酸耐受性，主要原因是在乙酸胁迫条件下，膜质ATP酶Pma1p泵出质子以维持胞内pH稳定性，而钾离子是主要回流的离子，因此乙酸胁迫条件下钾离子的吸收有助于质膜的电位平衡。与铁吸收相关基因FRE3、FIT2和FIT3敲除后，细胞在乙酸平板上的生长也受到抑制，但不如ARL1破坏后生长抑制程度明显，培养基中添加1–100 μmol/L FeSO4也没有看到对乙酸毒性的缓解作用，但发现细胞在4.2 g/L乙酸中培养30 min后，胞内铁的含量比没有经过乙酸胁迫处理的细胞提高了 2倍，说明乙酸可促进铁的吸收。由于铁可诱导氧化胁迫，因此细胞对铁的获得、代谢及氧化胁迫相关基因和蛋白的调控比较严格，这解释了为什么添加铁对细胞的乙酸耐性没有影响。本课题组近期研究表明，培养基中添加硫酸锌可明显改善细胞在高浓度乙酸(10–15 g/L) 条件下的乙醇发酵[7]。对高浓度乙酸存在条件下锌对细胞全局基因转录的影响进行研究，初步结果发现，与金属转运相关的多个基因在锌添加样品中出现明显下调，这些基因除了编码锌转运相关的蛋白(包括 Zrt1p、Zrt2p和Yke4p)以外，还包括铜转运(Ctr3p高亲和质膜铜转运蛋白)、钾转运(Kha1p，高尔基体K+/H+抗转运蛋白)以及铁转运(Mmt2p，负责线粒体铁积累的未知金属转运蛋白)相关的蛋白等。这些金属代谢相关蛋白基因转录的变化与乙酸耐性的关系正在研究中。

1.6 与乙酸耐性相关的转录调控因子

通过乙酸耐受性相关的基因聚类分析，与之相关的转录因子包括 Msn2p、Rim101p、Haa1p、Skn7p、War1、Pdr1、Stb5p、Nrg1p、Cbf1p、Gcr2p、Mig1p、Swi6p、Ume6p、Stp1p、Ace2p、Ino2p、Cst6p和 Rtg3p等[13]，其中 Haa1p是最主要的调节蛋白，负责调控 80%与乙酸耐性相关的基因[28-29]。对S. cerevisiaeBY4741亲本以及HAA1△突变体在含3 g/L乙酸、pH值为4的培养基中培养15 h，发现破坏子的延滞期比野生型延长了2.5倍，而且在此时期破坏子中活细胞数目相对野生型减少，而同样条件下不含酸的培养基中没有发现此现象，因此提出HAA1基因的表达可以缩短酵母在乙酸胁迫条件下生长的延滞期[13]。

在 Haa1p调控的靶基因很多，但很多基因的具体功能还不清楚。这些靶基因中，SAP30和HRK1表现出最强烈的对乙酸毒害的保护作用。SAP30编码脱乙酰酶复合体的一个亚基，HRK1编码调节质膜转录活性的蛋白家族中的一个蛋白激酶。敲除HRK1基因的酵母菌体内的乙酸的积累明显增加，提示这两个基因的作用很可能与降低胞内乙酸的含量有关[29]。Haa1p调节的基因还包括上文提到的编码细胞质膜上转运蛋白Tpo2p和Tpo3p。过表达HAA1可提高酿酒酵母的乙酸耐性，并发现转化子中TPO2和TPO3等Haa1p的靶基因上调[30]。

Haa1p转录因子直接调控许多能够响应乙酸胁迫的基因表达。对这些可能的调控基因的启动子区域的 DNA结合基序 (Binding motif)的研究表明，Haa1p的最小结合基序是5'-(G/C)(A/C)GG(G/C)G-3'。已发现有56个基因的表达受 Haa1p的直接调控，这些基因包括编码热激蛋白 Hsp30p和 Hsp26p，转运蛋白Pdr12p、Tpo2p和 Tpo3p以及转录调节蛋白Nrg1p、Msn4p、Mcm1p和Fkh2p等，所涉及的代谢过程包括细胞胁迫反应、糖代谢、细胞周期控制、蛋白合成以及降解等。此外，Haa1p还可通过对Msn4p和Mcm1p等转录因子的调控间接地调控近30个基因的表达，形成了复杂的代谢调控网络。进一步的研究表明，与 Haa1p亲和力最高的结合基序是5'-GAGGGG-3'，含有这个基序的基因包括TPO3、TPO2、STF2和AQR1等，但虽然具有这个基序的基因TPO2在乙酸胁迫下提高18.7倍，但是同样含有这个基序的AQR1只提高1.5倍，可见HAA1激活基因的表达还需要其他因子的参与。已发现无论培养基是否有乙酸存在，Haa1p都能与其下游调控基因TPO3结合，推测 Haa1p在无乙酸胁迫的条件下不具有功能，可能在乙酸胁迫条件下才具有转录激活功能[18]。

Msn2p和Msn4p是同一个家族的锌指蛋白，和酵母的多种耐性响应相关，如营养缺乏、高温、高渗透压、氧化胁迫等[31]。受 Msn2p和Msn4p调控的响应乙酸的基因包括编码分子伴侣蛋白Hsp26p和Sse2p的基因，与碳代谢相关的基因HXK1和GPD1和抗氧化相关的基因CTT1和GPX1等[32]，MSN2基因敲除后细胞在乙酸上的生长受到抑制，但MSN4敲除对细胞在乙酸上的生长影响不大，可能与Msn4p的作用比较温和有关[13]。本课题组对高浓度乙酸存在条件下锌添加对酵母菌全局基因转录影响的研究中，发现与未添加锌的对照组相比，锌添加可明显提高MSN2的转录水平 (未发表资料)，提示锌对高浓度乙酸胁迫条件下细胞活性的保护作用可能与MSN2的作用有关，但深入的分子机理还有待探讨。

Rim101p是C2H2(Cys2His2) 型锌指蛋白，已知有35个基因受其调控，这些靶点基因的功能与细胞壁结构的维持和铁的吸收有关，也有一些是功能未知的膜蛋白。敲除RIM101后细胞在乙酸中的生长受到抑制，显示该基因与细胞对乙酸毒性的反应和耐性有关[33]。

Nrg1p和Nrg2p是葡萄糖抑制作用的调节因子，近来报道它们也参与酵母菌的胁迫耐性响应基因的调控。当NRG1和NRG2两个基因都被敲除，菌体对高渗和氧化胁迫的抗性增强。Nrg所抑制的基因大都含有 STREs或者类似STRE的序列，而且还与MSN2和MSN4相关。推测NRG1/NRG2与MSN2/MSN4存在竞争关系，从而避免过度响应环境胁迫[34]。

值得指出的是，每个转录因子对靶基因的调控并不是相互独立的，不同转录因子可能具有共同的下游基因。利用YEASTRACT数据库(http：//www.yeastract.com)，将本文讨论的乙酸耐性相关基因中与能量代谢、氨基酸代谢的基因，以及与细胞壁合成相关基因和转运蛋白相关基因进行分析，得到的这些基因与 Msn2p、Nrg1p和Haa1p之间的相互关联见图2。

图 2 乙酸胁迫时转录调控因子 Msn2p、Nrg1p和Haa1p之间的关联Fig. 2 Transcriptional regulatory associations of Msn2p, Nrg1p and Haa1p in yeast cells under acetic acid stress. The model is based on the microarray data obtained in this study and on the information available in the YASTRACT database. Arrows indicate activation,lines indicate repression, solid lines mean documented regulation, dashed arrows or lines show potential regulation.

表 1为与乙酸胁迫反应相关的主要相关基因[8,13,20]。除了上文中提到的基因以外，还包括与蛋白修饰相关的基因及与细胞骨架蛋白合成及形态发生相关的基因。由于乙酸对细胞的影响主要是延迟期的延长，推测细胞骨架和形态发生相关基因破坏后，细胞不能在乙酸上很好生长的原因与突变体细胞生长受到抑制有关。

表1 酿酒酵母乙酸胁迫反应相关的基因Table 1 Genes related to acetic acid stress in S. cerevisiae

2 提高乙酸耐性的代谢工程操作

对酿酒酵母乙酸耐性的功能基因组研究发现了多个与乙酸耐性相关的基因，并在此基础上开发了相应的代谢工程改造方法。例如，过表达与乙酸耐受性密切相关的转录因子编码基因HAA1，所获得的菌株具有较高的乙酸耐性，在7 g/L乙酸平板上能较好生长，而对照在该乙酸浓度下没有检测到生长。这是利用功能基因组研究提高乙酸耐性的典型范例。

代谢物谱 (Metabolic profiling) 分析研究发现，在乙酸胁迫条件下木糖发酵的过程中，非氧化性的 PPP代谢途径代谢物核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸和景天庚酮糖-4-磷酸等明显积累，表明乙酸明显的减慢了木糖发酵速率, 因而通过对在这个过程中起重要作用的基因TAL进行过表达，发现过表达后菌株在1.8 g/L乙酸条件下的乙醇产量提高了1.72倍，而且有趣的是TAL过表达突变体在0.03 mol/L乙酸条件下比在没有乙酸条件下乙醇产量提高1.35倍，突变体核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸和景天庚酮糖-4-磷酸的含量都下降[35]。

对两株发酵性能相似的菌株YJS329和ZK2在不同抑制物条件下发酵，发现细胞膜结构、中心碳的代谢和抗氧化因子的不同是造成这两个菌株耐受性差异的主要因素，推测ZK2菌中油酸相关的基因ELO1、FEN1和OLE1的表达量高，所以具有较高的乙酸耐性，因此选择对ELO1在两株酵母菌YJS329和ZK2过表达，结果发现油酸分别提高了 17.6%和 9.4%，此外在高浓度乙酸 (10 g/L, pH 4.0) 冲击2 h后，过表达ELO1的重组酵母的细胞存活率明显提高。但同时也发现，两株菌过表达ELO1的重组菌细胞活性提高程度有一定的差距，分析是由于YJS329和 ZK2的遗传背景的不同导致。因此对菌株进行改造时需要考虑宿主遗传背景的影响[36]。

我国浙江大学学者首次将 RNA结合蛋白Lsm6p编码基因在木糖共发酵工业酵母中过表达，得到的转化子对硫酸的耐受性提高，而且转化子具有较高的木糖利用率和发酵效率。目前对于LSM蛋白在乙酸耐性中的研究还不多，其提高耐性的机理也不清楚[37-38]。

随着利用单基因敲除突变体文库获得的功能基因组学信息的不断积累，人们希望通过所获得的信息设计代谢工程改造的方法，提高菌株的发酵效率。分析BY4741敲除突变体相关结果，研究者找到11个基因与乙醇、乙酸及另外两种常见的纤维素水解液中的毒性抑制物糠醛及香草醛耐性相关的基因，并利用相应突变体进行超高浓度乙醇发酵及小麦秸秆水解液发酵实验，证明BUD31和HPR1与乙醇收率和发酵速率有关，ERG1、PRS3、RAV1、PRP4和VMA8与小麦秸秆水解液中细胞活性的保持和利用该底物的发酵速率有关[39]，但这些基因在工业酵母中的作用没有进行研究，也没有进行这些基因过表达后乙醇发酵性能的评价。

3 存在问题和展望

提高酵母菌的乙酸耐受性可以保证酵母菌发酵过程中较好的细胞活性和较高的发酵性能，随着基因组学、转录组学、代谢组学等手段的发展，对酿酒酵母乙酸耐受性的机理研究不断深入，然而目前存在的问题是：

1) 目前的研究多使用转录组，研究基因转录的变化，但由于存在转录后和翻译后修饰，以及蛋白间相互作用等调节，酵母菌转录组学的变化不一定反映到蛋白水平的变化。

2) 耐受性与乙醇发酵效率受不同的基因控制，耐性的提高不一定必然带来发酵效率的提高[32]，因为耐性相关基因的作用只有在特定胁迫条件下才发挥作用。

3) 目前对功能基因组的研究更多地关注结构基因的功能，但酵母菌的非编码RNA，启动子活性等都对代谢工程改造具有重要影响[40-41]。

未来对酿酒酵母乙酸耐性的研究将深入揭示翻译后修饰等水平的调节机制，并进一步开发非编码RNA和启动子等遗传组件，将其用于利用合成生物学手段构建高效的发酵菌株，将具有广阔的应用前景。在制定代谢工程策略的时候，需要结合不同宿主背景和培养条件，考虑不同层次的代谢调控。随着对酿酒酵母乙酸耐性分子机制研究的深入，更多理性的代谢工程改造将成功用于选育高效的工业酿酒酵母菌株。此外，乙酸也作为食品防腐剂用于抑制一些导致腐败的酵母。对这些腐败相关酵母的乙酸耐性机理具有深入认识，也对食品领域防止食品腐败具有重要应用意义。

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