优良枯草芽胞杆菌的筛选及对小鼠安全性评价

王 苇，秦 瑶，周 霞，屈勇刚，王礼伟，郭秉娇，王熙楚，李 劼，王晓兰

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003）

益生菌是通过定植作用改变宿主某一部位菌群组成、从而产生有利于宿主健康作用的单一或组成明确的混和微生物，目前广泛应用于食品发酵、医疗保健和畜牧业生产领域［1-4］。我国允许作为生态制剂的微生物有乳酸菌、粪肠球菌、芽胞杆菌和酵母菌等。枯草芽胞杆菌作为一种主要的益生菌，以其具有生物夺氧、拮抗致病微生物，改善体内外生态环境、增强动物体的免疫功能、产生多种消化酶、产生多种营养物质的作用［5］，已成为目前饲料添加剂中最富有活力的产品。

枯草芽胞杆菌应用于动物生产时，优良菌株的筛选以及菌株的安全性是关键。为此，本研究基于16SrRNA基因序列分析进一步确定分离于鸡粪便的13株枯草芽胞杆菌，通过一系列手段筛选性状优良的枯草芽胞杆菌，同时进行生物安全性评价，为后期的开发应用提供有用数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 疑似枯草芽胞杆菌13株，分离于石河子大学动物科技学院试验站饲养的杂交肉鸡粪便，并通过形态学和生化试验进行了初步鉴定。

1.1.2 试剂 抗菌药物纸片：哌拉西林、阿米卡星、四环素、诺氟沙星、氨曲南、多黏菌素B、复方新诺明、特治星、甲氧苄啶、氟苯尼考均购自杭州微生物试剂有限公司；LB固体培养基和液体培养基：按实验室常规方法配制。

1.1.3 实验动物 健康小鼠，体重33g±3g，由石河子大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 提取细菌DNA模板 参照文献［6］进行。

1.2.2 16SrRNA PCR扩增与测序 应用Premier 5.0软件设计上、下游引物k1与k2。k1：5-GCGGCTTCGGCTGTCACTTAT-3，k2：5-CTTCGCCACTGGTGTTCCTCC-3，目的片段长为439bp，由北大华大基因工程有限公司合成。PCR产物交由北大华大基因工程有限公司测序。

1.2.3 序列比较分析 测序结果在GenBank数据库中进行16SrRNA序列比对分析，同源性大于99%的细菌判定为同种细菌；同源性介于95%～99%判定为同属；同源性在91%～95%判定为同科［7］。最终应用DNA Star软件对PCR产物测序结果进行同源性分析。

1.2.4 菌株生物学特性测定 菌株耐酸能力测定、菌株耐胆汁盐能力测定 、菌株耐高温能力测定均参照文献［8-9］进行；采用常规K-B法选择常用的10种抗菌药物对菌株进行抗菌药物敏感性测定。

1.2.5 分离株的安全性评价 小鼠随机分成A1、A2、B1、B2共4个组，每组10只。A1组腹腔注射0.3mL菌液（活菌数量为1.6×109CFU／mL），A2组腹腔注射相同剂量灭菌LB肉汤作为对照；B1组口服0.4mL菌液（活菌数量为1.6×109CFU／mL），B2组口腔灌服灭菌的LB肉汤0.4mL作为对照，连喂3d。7d后，定期观察小鼠精神状况、食欲、活动、粪便等。最后称重并处死小鼠，取出脏器，并称量，求脏器系数［10］，观察各脏器病理变化。

脏器系数＝实验动物某脏器的重量／动物体重

小鼠试验前后体重、小鼠增重以及各内脏脏器系数用平均数±标准差（±SD）表示，用SPSS17.0软件进行数据分析。

2 结果

2.1 菌株的PCR结果

13株菌株中有10株菌株扩增到了大约439bp基因片段，分别命名为Q01-Q10（图1）。

2.2 菌株的16SrRNA测序结果

图1 枯草芽胞杆菌PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of Bacillus subtilis

10株菌PCR扩增片段测序后与GenBank数据库中枯草芽胞杆菌（登录号：NC000964）序列比对，同源性均在90%以上。其中，Q04、Q05、Q09为99%，Q01、Q08为95%，而其余5株菌为94%（图2）。系统进化树分析表明10株枯草芽胞杆菌16SrRNA序列处于不同分支，Q04、Q05、Q09在同一分支上。

图2 分离株PCR扩增片段同源性分析和系统进化分析结果Fig.2 The homology and phylogenetic analysis results of PCR amplification fragments of isolates

2.3 菌株的生物学特性

2.3.1 菌株耐酸和耐胆盐能力 Q04、Q05及Q09在pH为2.5时活菌数最多。其中Q04在pH2.5的情况下，0～2h时细菌数量有较大幅度的增加，2h～4h时细菌数量则出现显著的下降，在4h～6h时细菌数量再次增加（图3）。Q04在胆盐浓度为2.0g／L时活菌数最多（图4）。

2.3.2 菌株耐高温能力 Q04、Q05及Q09可以在50℃～100℃很好的耐高温，其中Q04对温度的耐受能力高于Q05和Q09。特别是在100℃处理后，Q04的存活率显著高于其他2个菌株。

2.3.3 菌株对抗菌药物敏感性 3株枯草芽胞杆菌对氨曲南、复方新诺明以及甲氧苄啶耐受程度较高，而对哌拉西林、阿米卡星、四环素、诺氟沙星、特治星、氟苯尼考敏感。而Q04对于多黏菌素具有耐受性，其他2个菌株则对多黏菌素较为敏感（表1）。

2.4 菌株对小鼠的安全性

试验期间，小鼠均存活且小鼠体征均未见明显变化，各组小鼠体重均有增加，但A1与A2、B1与B2比较均无显著差异（P＞0.05）（表2）。剖解小鼠，检测心、肝、脾、肺、肾、脑等各脏器，肉眼观察并无明显异常。同时A1与A2、B1与B2脏器系数相比较均无明显差异（P＞0.05）（表3）。

表1 3株枯草芽孢杆菌对抗菌药物的敏感性Table 1 The antimicrobial sensitivity results of 3 Bacillus subtilis isolates 个

图3 枯草芽胞杆菌Q04对不同pH酸的耐受结果Fig.3 The tolerable results of Q04to acid of different pH

表2 腹腔注射和口腔灌服处理前后体重差异比较Table 2 Comparison of difference in weight of mice before and after intraperitoneal injection and oral gavage g

3 讨论

芽胞杆菌传统上分类鉴定多依照《伯杰氏细菌鉴定手册》，其中个体形态和生理生化反应方法是最经典、最常用的芽胞杆菌分类鉴定指标，但传统方法只能初步确定［11］。Ibrahim等对B.pallidus进行16S rRNA测序构建系统发育树，得出其与芽胞杆菌属有很大的区别，与Geobacillus很相近，故将它归入Geobacillus［12-14］。利用传统方法结合该技术可以更准确地鉴定细菌［12］。本试验将鸡粪便中分离并通过细菌形态特征、染色镜检观察及生化鉴定获得13株芽胞杆菌，通过16SrRNA进行进一步鉴定，最终确认3株为枯草芽胞杆菌。

图4 枯草芽胞杆菌Q04对不同浓度胆盐的耐受结果Fig.4 The tolerable results of Q4to bile salt of different concentrations

表3 试验小鼠不同脏器系数比较Table 3 Comparison of different organ coefficients in mice

枯草芽胞杆菌已广泛应用于各个领域，如何保证菌株在动物体内的存活率及菌群数量尤为重要。本试验对3株枯草芽胞杆菌进行了耐高温、耐胆盐、耐酸以及对抗菌药物敏感性生物学特性研究，其中Q04对抗菌药物敏感性与其他2株枯草芽胞杆菌差异性不大，通过综合分析Q04具有良好的生物学特性。益生菌使用的安全性是另外一个关键环节，如菌株的内在特性、菌株的药物代谢动力学、菌株与宿主之间的相互关系等［15］。可以通过脏器系数、半数致死量、急性毒性、最小致死量、最大耐受量、体重变化等试验实现上述目标［16-18］。脏器系数的差异性可反映对脏器的毒性综合情况，也是寻找毒性作用靶器官的重要线索［17］。体重是动物试验中重要的非特异性观察指标，可综合反映动物机体中毒效应，是动物试验重要指标之一［18］。

本试验结果表明，灌胃或腹腔注射枯草芽胞杆菌Q04的小鼠均健康存活，生理学特征和脏器系数未见异常，体重较对照组有所增加。也有研究将2株芽胞杆菌饲喂小鼠，其结果显示脏器系数与对照组无显著差异（P＞0.05）［19］。这与本试验结果一致，由此推断枯草芽胞杆菌Q04对小鼠是安全的。

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