菊花总黄酮对去势导致雄兔干眼症泪腺细胞Bax、Bcl-2表达的影响

姚小磊，彭清华，陈启雷，唐勇华，钟 茜

（1．广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；

2．湖南中医药大学第一附属医院中医眼科学重点学科，湖南 长沙 410007）

菊花总黄酮对去势导致雄兔干眼症泪腺细胞Bax、Bcl-2表达的影响

姚小磊1，彭清华2，陈启雷1，唐勇华1，钟 茜1

（1．广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；

2．湖南中医药大学第一附属医院中医眼科学重点学科，湖南 长沙 410007）

目的 观察菊花总黄酮对去势所致干眼症白兔泪腺凋亡相关基因蛋白Bax、Bcl-2表达的影响，探讨菊花总黄酮治疗干眼症的作用机制。方法 将150只雄性日本大耳白兔随机分为正常组（A组）、假手术组（B组）、模型组（C组）、雄激素对照治疗组（D组）和菊花总黄酮治疗组（E组）。分别于治疗后1、3和5个月每组处死10只，取材用于相关指标检测。C组、D组、E组行双侧去势术建立白兔干眼症模型。E组白兔用菊花总黄酮灌胃治疗，D组用雄激素肌肉注射，A组、B组、C组用生理盐水灌胃。全部白兔行SchirmerⅠ实验，并检测泪膜破裂时间，处死后取泪腺组织，采用免疫组织化学法检测泪腺组织中凋亡相关基因蛋白Bax、Bcl-2的表达，并计数凋亡细胞数量。结果 E组SchirmerⅠ实验测量所得滤纸湿长明显高于C组（P＜0.01），泪膜破裂时间明显长于C组（P＜0.01）。E组治疗1、3和5个月后，泪腺导管及腺泡上皮细胞中Bax阳性表达的细胞数均明显低于C组，Bcl-2阳性表达的细胞数均明显高于C组，细胞凋亡数量均明显低于C组（P＜0.01）。结论 菊花总黄酮中主要成分为黄酮类物质，可显著抑制雄激素水平降低后白兔干眼症的发生，抑制泪腺细胞凋亡，维持泪腺基础分泌量和泪膜的稳定性。

干眼症已成为目前眼科研究的热点问题。雄激素水平下降是干眼症的重要发病原因，已逐渐成研究热点。菊花有效部位为黄酮类物质[1]。雄激素、黄酮均为杂环多酚类化合物，目前研究已证明某些黄酮类化合物具有拟雄激素作用[2]，可以用于治疗因雄激素水平下降所致的疾病[3]。利用放射性示踪标记的方法研究还表明，黄酮是细胞雄激素受体（androgen receptor，AR）的刺激物，可以与细胞AR结合发挥生物学效应[4]。我们因此提出假说：菊花中所含黄酮也应该可与AR结合，产生拟雄激素效应，治疗雄激素水平下降导致的干眼症。因此我们制备菊花总黄酮，并制作去势白兔干眼症模型进行研究，旨在探讨菊花总黄酮对抗雄激素水平下降所致干眼症的治疗效果以及是否能够抑制泪腺组织的细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 取健康2月龄雄性日本大耳白兔150只 （上海斯莱克实验动物有限公司提供，SPF级，许可证号：2012-0361，远交系），体质量2.0~2.5 kg。裂隙灯显微镜、眼底镜检查眼前节及眼底无异常，0.5%的卡因眼液表面麻醉后SchirmerⅠ试验（SchirmerⅠ test，SIT）检测5 min≥10 mm和泪膜破裂时间（break up time，BUT）≥10 s检查的白兔方可使用。

1.1.2 药物 菊花总黄酮，由浙江大学苏州工业技术研究院生产（批号：JH130804）。

1.1.3 试剂 芦丁对照品 （芦丁≥98%；批号：MUST-12040302成都曼斯特生物科技有限公司）。5%BSA封闭液，兔抗兔Bax、Bcl-2多克隆抗体，生物素化山羊抗兔IgG（FITC-IgG），过氧化物酶标记链酶白卵素（atrept avidin-biotin complex，SABC）免疫组织化学试剂盒，3，3-二氨基联苯胺 （3’，3-diaminobenzidine，DAB）显色剂（均购自武汉博士德生物工程有限公司）。

1.1.4 仪器及设备 TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；EYELA SB-1100旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；DLSB-5/20低温冷却液循环泵 （郑州长城科工贸有限公司）；AL-204电子天平 （METTER TOLEDO公司）LEICA DM LB2型双目显微镜 （德国LEICA公司生产）；Shandon325型石蜡切片机 （英国Shandon公司生产）；DNP-9162型电热恒温培养箱 （上海精宏实验设备有限公司生产）；Motic B5显微摄像系统（麦克奥迪实业集团公司生产）；MIAS-1000型高清晰度彩色病理图文分析系统。

1.2 方法

1.2.1 菊花总黄酮的制备 菊花有效部位的提取方法：首先对乙醇浓度、提取时间、提取温度和提取次数进行单因素考察，并通过正交优化设计，寻求了醇提最佳工艺条件；再通过静态吸附实验、动态吸附实验，优化出纯化杭白菊总黄酮的良好大孔树脂以及最佳吸附条件、洗脱条件。杭白菊干燥花蕾15 kg粉碎后，醇提2次（第1次：原药材浸泡10倍量80%乙醇，加热至80℃提取2 h，过滤；第2次：第1次提取的药渣浸泡8倍量的80%乙醇，加热80℃提取1 h），浓缩后水沉，离心过滤，滤液上AB-8大孔树脂柱，用体积分数为80%的乙醇进行洗脱，洗脱液浓缩，经真空带式干燥后粉碎得总黄酮干粉。

1.2.2 动物分组 对此150只雄兔，采用随机数字法分为A1、B1、C1、D1、E1、A3、B3、C3、D3、E3、A5、B5、C5、D5、E5共15组，每组10只。其中：A代表：正常组；B代表：假手术组；C代表：模型对照组；D代表：雄激素对照治疗组；E代表：菊花总黄酮治疗组；1、3、5分别代表药物干预1、3、5个月，见表1。

表1 动物雄兔分组表

1.2.3 雄激素水平下降导致干眼症动物模型的制作 参照作者前期研究的方法[5]，行双侧睾丸切除术（ORX）：将C、D、E 3组实验兔切除双侧睾丸及附睾。B组只切开阴囊，不切除睾丸，作为假手术对照。

1.2.4 给药方法 各组在造模后1周，待伤口基本愈合后开始用药。菊花总黄酮的灌胃剂量和丙酸睾酮注射量均按成人常用剂量，通过体表面积换算方法进行计算 （白兔以2 kg体质量为标准，人以60 kg体质量为标准）。A、B、C组以0.9%生理盐水5 000 mg/kg灌胃，1次/d；D组丙酸睾酮注射液以1∶4麻油稀释后按500 mg/kg大腿肌肉注射，1次/3 d；E组以1%菊花总黄酮生理盐水混悬液 （即10 mL生理盐水中溶菊花总黄酮63.6 mg），5 g/kg灌胃（通过体表面积换算，按60 kg的成人每天服用30 g菊花原药材计算），1次/d。

1.2.5 STU和BUT检查 取材前先完成基础分泌量、泪膜稳定性测定 分别于分组前、末次给药完成后对此150只雄兔分别于进行SIT和BUT检查，检测标准参照SIT与BUT的诊断标准[6]。SIT测定参照有关文献[7]。正常滤纸大小 （5 mm×35 mm）的Whatmean 41号滤纸条，将一端折弯5 mm，置于下睑内侧1/3结膜囊内，其余部分悬垂于皮肤表面。人工使实验动物闭眼，5 min后测量滤纸湿润长度（不包括反折）。BUT测定：用玻璃棒蘸2%荧光素钠溶液在下睑结膜囊内涂抹，使眼睑闭合荧光素均匀分布于角膜表面后，固定其上下睑使角膜充分暴露，于裂隙灯下用钻蓝光照射观察，从实验动物瞬目后睁眼开始计时，记录泪膜上出现第一个破裂点的时间。

1.2.6 免疫组织化学法检测方法 SIT和BUT检查完后立即以断头法处死动物，即刻摘除泪腺。予以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，供免疫组织化学方法使用。每组石蜡块予以石蜡切片机连续切片，脱蜡至水，蒸馏水洗涤2 min×2次。免疫组织化学法检测严格按照说明书操作。显微镜下观察泪腺组织中泪腺导管细胞及腺泡上皮细胞的细胞凋亡以及免疫组化染色情况。Motic B5显微摄像系统进行摄像并经免疫组织化学测量系统以2.105 μm为像素点长，在1.271×106μm2窗口面积下测量凋亡相关基因Bax、Bcl-2蛋白的平均光密度值，行半定量分析。并随机统计各组5~7个高倍视野(×400倍)中的凋亡细胞总数，计算每高倍视野下的平均细胞数。

1.3 统计学分析

用SPSS 13.0软件进行统计学分析，双侧检验，P<0.05为差异有统计性意义。资料用“±s”表示。先进行正态分布及方差齐性检验，若呈正态分布，方差齐，多组比较采用方差分析，治疗后多组比较，以治疗前数值为协变量，进行协方差分析，治疗前后比较用配对t检验，方差不齐者进行Satterthwaite方法进行校正t检验，非正态分布采用Wilcoxon秩和检验。

2 结果

2.1 菊花总黄酮提取质控结果

菊花药材15 kg提取，得到成品300 g。紫外标准曲线法测定提取物中总黄酮的含量：用已经制备的芦丁标准品对照液作为对照，建立紫外标准曲线，并进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率实验，紫外法测定成品中总黄酮含量。成品中总黄酮含量达73.5%，收率为4.9%，总黄酮的提取率为42.1%。

2.2 基础泪液分泌量

SIT检测基础泪液分泌量，经自身前后配对t检验显示，C1、C3、C5组白兔去势后基础泪液分泌量明显减少，与去势前比较，差异有统计学差异（P< 0.01）。方差分析显示，与C1组比较，C3和C5组白兔的泪腺分泌量下降（P<0.05，P<0.01）。

E组SIT值与相同时间点的C组比较，以治疗前的SIT值为协变量，经协方差分析，E组基础泪液分泌量增加，滤纸湿长明显增长（P<0.01）。见表2。

2.3 泪膜稳定性

BUT检测模型组泪膜稳定性，经自身前后配对t检验显示，C1、C3、C5组BUT明显缩短，与去势前比较差异有统计学意义（P<0.01）；方差分析显示，与C1组比较，C5组白兔的BUT更短 （P< 0.05）。

E组在不同治疗时间后比较，E5组的泪膜稳定性较E1组降低（P<0.05），其他各时间点之间BUT值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。以治疗前的泪膜破裂时间为协变量，经协方差分析，治疗组泪膜稳定性增加，BUT与相应时间点模型组比较明显延长（P<0.01）。见表3。

表2 白兔各组治疗前后SIT测量值 （±s，mm，n=10）

表2 白兔各组治疗前后SIT测量值 （±s，mm，n=10）

注：与同组给药前比较**P<0.01；与给药1个月组比较△P<0.05，△△P<0.01；与同时期模型（C）组比较##P<0.01。下表同。

组别A组 给药前给药后B组 给药前给药后C组 给药前给药后D组 给药前给药后E组 给药前给药后1个月后15.3±5.7 15.5±5.9 15.0±5.7 15.4±6.0 13.4±2.3 6.7±2.3** 13.2±2.3 13.0±2.3 13.4±3.3 14.7±5.3##3个月后14.8±5.2 15.3±5.0 14.8±5.3 15.1±5.0 15.5±4.3 4.7±1.0**△15.0±4.3 15.7±4.6 14.7±3.7 13.3±5.7##5个月后15.3±4.2 16.1±6.0 15.3±4.8 15.1±4.9 14.5±3.1 2.7±2.0**△△15.6±3.4 14.9±4.2 14.5±3.0 12.7±5.2##

表3 白兔各组治疗前后BUT测量值 （±s，s，n=10）

表3 白兔各组治疗前后BUT测量值 （±s，s，n=10）

组别A组 给药前给药后B组 给药前给药后C组 给药前给药后D组 给药前给药后E组 给药前给药后1个月后14.3±3.2 14.5±2.6 14.3±3.3 14.6±2.6 13.6±1.8 7.4±1.1** 13.2±1.0 12.2±1.1 14.6±2.8 14.9±4.4##3个月后15.3±0.3 14.1±6.0 15.1±3.3 14.0±6.1 14.5±4.1 6.7±2.3** 14.7±4.2 13.8±2.8 14.6±2.2 12.8±2.7##5个月后14.8±5.7 15.3±4.4 14.8±5.8 15.3±4.4 13.5±4.1 4.7±2.1**△13.1±4.2 13.7±2.4 13.8±1.7 11.8±4.4##△

2.4 泪腺细胞凋亡

C1、C2、C3组去势后细胞凋亡明显增强，泪腺腺泡和导管上皮中均可见散在的阳性凋亡细胞，与相应的A组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；与C1组比较，C5组的泪腺细胞凋亡数量增加 （P< 0.05）。光学显微镜下可见凋亡细胞核呈棕黄色，有的细胞核中染色物质集中于核膜下呈不规则环形或半月形，或可见分裂的细胞核。E1、E2、E3组的细胞凋亡数量下降，与相应时间点C组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。见表4。

A组、B组Bax及Bcl-2蛋白表达不明显。C组泪腺导管和腺泡中可见大量Bax蛋白表达于细胞膜和细胞浆中，呈棕黄色颗粒，而Bcl-2表达不明显。治疗组Bax表达较相应时间点模型组减弱，Bcl-2表达增强，可见其大量表达于细胞膜和细胞浆中，呈棕黄色颗粒。见表4和图1、2（第64页彩图）。

表4 各组治疗后泪腺组织中Bax、Bcl-2表达及细胞凋亡情况（±s，n=10）

表4 各组治疗后泪腺组织中Bax、Bcl-2表达及细胞凋亡情况（±s，n=10）

注：与给药1个月组比较△P<0.05，△△P<0.01；与同时期正常组比较▲▲P<0.01；与同时期模型（C）组比较##P<0.01。与C1组比较*P<0.05。

Group A组 1个月后3个月后5个月后B组 1个月后3个月后5个月后C组 1个月后3个月后5个月后D组 1个月后3个月后5个月后E组 1个月后3个月后5个月后Bax光密度值0.082±0.010##0.084±0.024##0.086±0.028##0.079±0.011##0.085±0.018##0.084±0.018##0.441±0.094 0.561±0.048 0.497±0.047 0.141±0.091##0.166±0.158##0.144±0.073##0.156±0.021##0.176±0.066##0.188±0.013##△Bcl-2光密度值0.114±0.027 0.124±0.014 0.163±0.024 0.115±0.014 0.125±0.024 0.095±0.065 0.174±0.044 0.145±0.055 0.172±0.021 0.505±0.114##0.495±0.024##0.425±0.065##0.411±0.104##0.499±0.094##0.533±0.076##△△凋亡细胞数量12.34±4.67 13.01±5.55 12.87±3.22 15.31±4.07 15.04±5.50 13.87±4.02 46.45±9.27▲▲59.23±10.32▲▲71.41±11.68▲▲* 11.78±3.91##20.27±4.89##30.89±5.67##12.27±3.21##21.28±4.09##31.88±5.60##

3 讨论

3.1 中医对于菊花及相关方剂治疗干眼症的佐证论述

干眼症根据其症状，轻症可归属于“白涩症”，重症可归属于“神水将枯”。《秘传眼科龙木论》论述：“目涩者何也？答曰：此乃熏脏腑也……液道枯干，脏腑邪热传于卫，真气不荣于目，故目涩也。依用羊肝丸。”（所载“羊肝丸”第一味药即菊花）可见“神水将枯”病机为内因在脏腑之邪热伤阴液，邪热传于卫表则为风热。而《素问·宣明五气篇》说：“五脏化液，肝为泪”，《银海精微》说：“泪乃肝之液”，可见“神水将枯”所病脏腑在肝，所以治疗原则应在内清肝热、养肝阴，在外清肺卫风热。

菊花入肝经，既能清肝，又能养肝，还可入肺经，清肺卫风热[8]，为治疗干眼症理想药物。《银海精微》、《原机启微》、《眼科龙目论》、《目经大成》 等所收录的许多治疗干眼症症状的代表方剂，如秘方菊花散方、菊花散、蝉花散、菊睛丸、五秀重明丸、白菊清金散等，以及《审视瑶函》中治疗“白涩症”的桑白皮汤，方中皆有菊花，且大都为君药；特别是《眼科龙目论》说“菊花散，理肝气风毒、眼目赤肿、昏暗羞明、隐涩难开”，《银海精微》说“蝉花散，治肝经蕴积、热毒伤肝、上攻于目”，《原机启微》说“五秀重明丸，治翳膜遮睛、瘾涩昏花”，都体现了菊花治疗干眼症的重要性。可见菊花在内可清肝之积热，滋肝之阴液，在外清卫表风热，为治疗干眼症的理想药物，具有良好的中医理论依据。

3.2 雄激素水平下降将引起泪腺局部细胞凋亡

正常泪腺极少发生细胞凋亡现象，而在干眼症患者和动物模型中发现结膜上皮细胞和泪腺腺泡细胞的凋亡增加[9-10]。大量研究证实[11]，Bcl-2基因产物具有明显抑制细胞凋亡的作用，可延长细胞寿命，增加细胞数目。Bax蛋白可促进细胞凋亡，对抗Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡的作用[12]。

研究发现[13]，应用雄激素后，除使兔泪腺腺体中淋巴细胞浸润程度明显减轻的同时，泪腺中的Bax mRNA也明显减少，而 Bcl-2、c-myb、及AR mRNA都明显增加。另外，Azzarolo等[14]研究还发现雄激素有防止泪腺细胞凋亡、坏死和淋巴细胞浸润的作用。这说明雄激素水平高低与干眼症的泪腺细胞凋亡和炎症之间有密切的关系。

3.3 菊花提取物对泪腺局部细胞凋亡的影响

雄激素水平下降是干眼症发生的一个重要原因，雄激素替代治疗是有明确疗效的，但是长期使用雄激素将会导致一系列相应副作用的发生。目前研究已证明某些黄酮类化合物具有拟雄激素作用[2]，有望成为雄激素替代药物，以规避雄激素的副作用[3]。在作者参与的同类研究中，就发现密蒙花总黄酮灌胃，对于雄激素水平下降的动物模型有较好的实验疗效[15-16]，并且可以抑制泪腺组织的细胞凋亡[17]，使大鼠泪腺中 Bcl-2 mRNA表达增加，降低Bax mRNA的表达，但随病程的延长其作用弱于雄激素[18]，为本研究提供了很好的借鉴作用。在本研究中我们发现，D1、D3、D5组以及E1、E3、E5组泪腺组织中的Bax平均光密度值较C1、C3、C5组降低，差异均有统计学意义(均为P<0.01)；D1、D3、D5组以及E1、E3、E5组泪腺组织中的Bcl-2平均光密度值较C1、C3、C5组增高，差异均有统计学意义(均为P< 0.01)，说明促凋亡因子Bax在泪腺局部受到雄激素和菊花总黄酮的抑制，而抑凋亡因子Bcl-2在泪腺局部受到雄激素和菊花总黄酮的激活，菊花总黄酮的效应与雄激素类似，与同类研究结果有一致性[18]；但随着时间的推移，菊花总黄酮对凋亡因子的影响开始逊于雄激素，D5组与E5组之间的差异开始有统计学差异(P<0.05)，可能与实验动物对菊花总黄酮的拟激素效应逐渐适应有关，可考虑进一步研究。本实验研究表明，通过菊花总黄酮的干预，抑制了细胞凋亡，表现为治疗组泪腺组织中Bcl-2表达显著提高，而Bax显著降低，因此泪腺局部的细胞凋亡数量减少，正常泪腺细胞得到保护，使处于凋亡阶段的细胞退出凋亡程序。对于雄性去势白兔来说，这可能与菊花总黄酮发挥了雄激素替代作用相关，与Toda等[13]的实验中雄激素能够提高泪腺局部Bcl-2表达而抑制Bax表达的结果相符合。正常泪腺细胞得到保护之后，泪液分泌得到保障，表现为泪液基础分泌量试验以及泪膜破裂时间测量值的好转，使E组SIT、BUT接近A组。

根据本研究结果，我们认为菊花总黄酮可以抑制泪腺腺泡和腺管细胞的细胞凋亡，提高泪液基础分泌量，维持泪膜稳定性，改善眼表干燥状态，其机制可能与菊花总黄酮的拟雄激素效应有关，有待进一步研究。

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（本文编辑 杨 瑛）

Effects of Total Flavonoids of Chrysanthemum on Bax and Bcl-2 Expressions of Lacrimal Gland Cells Apoptosis of Castrated Rabbits with Dry Eye

YAO Xiaolei1,PENG Qinghua2,CHEN Qilei1,TANG Yonghua1,ZHONG Qian1
（1.Ruikang Affiliated Hospital of Guangχi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangχi 530011,China;2.Key Discipline of Ophthalmology of Chinese Medicine,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

Objective To evaluate the effects of the total flavonoids of chrysanthemum onbasic tears secretory volume,tear film stability,expressions of Bax and Bcl-2 of castrated rabbits with dry eye,and investigate the therapeutic effects of the total flavonoids on dry eye caused by gonadal hormones level imbalance.Methods 150 rabbits were divided into blank group(group A),sham-operated group (group B),untreated group (group C),androgen group (control treatment group,group D),and total flavonoids of chrysanthemum group (treatment group,group E).The dry eye models were established with orchiectomy on the group C,group D and group E.Rabbits in the group E were treated with total flavonoids of chrysanthemum.Rabbits in the group D were treated with androgen intramuscular injection.Rabbits in the group A,group B and group C weretreated with normalsaline.Allrabbitsweredetected with SchirmerⅠexperimentand the tearbreak-up time (BUT)was evaluated fordry eye.Bax,Bcl-2 were checked on immunohistochemistry. Results The Schirmer's I test values of the treatment group was significantly higher than that of the untreated group(P<0.01)and the BUT value of the treatment group was significantly longer than that of the untreated group(P<0.01). The quantity of expression of Bax in acinar epithelial cell and glandular tube cell of the treatment group were significantly higher than that of the untreated group(P<0.01)and the expression of Bcl-2 in acinar cell and glandular tube cell of the treatment group were also significantly higher than that of the untreated group(P<0.01).Conclusion The main components of chrysanthemum are the flavonoids,which could significantly inhibit the syndrome of dry eye in rabbit after androgen level lowered and lacrimal gland apoptosis and keep basic tears secretory volume and tear film stability.

castrate;dry eye;lacrimal gland;apoptosis;total flavonoids of chrysanthemum

R285.5；R777.2

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.003.012.06

2014－05－21

国家自然科学基金地区基金项目（81260550）；广西壮族自治区自然科学基金资助项目（2012GXNSFBA053092）；广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项基金资助项目（GZPT1221）。

姚小磊，男，医学博士，讲师，主治医师，研究方向：中西医结合治疗眼表疾病、眼底病。

〔关键词〕去势；干眼症；泪腺；细胞凋亡；菊花总黄酮