哈尔明碱对人白血病HL-60细胞增殖的抑制作用及机制探讨

孙亚军，张春德

(天津医科大学总医院，天津300052)

白血病是我国发病率较高的癌症之一，尽管其诊断和治疗取得了较大进展，但其总体预后依然较差。哈尔明碱是一种具有抗肿瘤活性的生物碱类化合物，被认为能够调控细胞生长、生存、分化、增殖、迁移等细胞进程，同时还参与了多种信号传导途径［1］。本研究观察了哈尔明碱对白血病HL-60细胞增殖和周期的影响，为其进一步临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人白血病HL-60细胞购自美国ATCC细胞库;哈尔明碱(＞98%)购自Sigma公司;细胞周期检查试剂盒购自BD Biosciences公司;实时荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司;STGC3、CDK1、p27、p53和p-AKT抗体购于Santa Cruz公司;抗βactin一抗购自 Sigma公司;MTS试剂、NF-κB和AP-1荧光表达质粒购于美国Promega公司。

1.2 细胞培养及药物处理 人白血病HL-60细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养箱于37℃、5%CO2条件下培养。哈尔明碱粉末以DMSO溶解制备成储存液，使用前以无血清培养基稀释至实验浓度，过滤后使用。

1.3 哈尔明碱对HL-60细胞增殖影响的观察 采用MTS法。将肿瘤细胞调整为5×105/mL，每孔加入100 μL细胞悬液于 96孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育24 h，实验组分别加入 1、2、10、20、100 μg/mL 哈尔明碱作用 24 h，更换新鲜培养基，加入20 μL MTS，孵育 2 h，酶标仪测定 490 nm的吸光值(OD值)。以0 μg/mL组作为对照组，细胞抑制率(%)=［1－(OD值实验组/OD值对照组)］×100%。为避免哈尔明碱的肿瘤抑制作用对结果的干扰，选择对HL-60细胞抑制率＜10%的哈尔明碱浓度进行下述实验。

1.4 哈尔明碱对HL-60细胞周期影响的观察 采用流式细胞仪检测。将3×105细胞培养在6孔板中孵育24 h，实验组加入1、2 μg/mL哈尔明碱作用24 h(分别为实验1组、实验2组，下1.5～1.8分组同)，消化后离心，PBS洗涤2次，加入1 mL预冷的70%乙醇4℃固定过夜，离心去乙醇，PBS洗涤1次，加入400 μL含有RnaseA的PI染液，室温孵育15 min，PBS洗涤后，流式细胞仪检测。对照组细胞中未加入哈尔明碱进行培养，操作同上。

1.5 HL-60细胞中与细胞周期、增殖相关的基因蛋白检测 采用Western blotting法。3×105细胞培养在6孔板中孵育24 h后，实验组加入1、2 μg/mL哈尔明碱作用24 h，将细胞用RIPA裂解法提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。100 μg蛋白样品经10%SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜(150 mA，1 h)，5%脱脂牛奶封闭1 h后，再加入一抗(STGC3，1∶400;CDK1，1∶400;p53，1∶400;p27，1∶400;p-AKT，1∶200;β-actin，1∶4 000)4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次后，加入二抗室温孵育1 h，ECL荧光显影，以β-actin为内参计算各蛋白含量。对照组细胞中未加入哈尔明碱进行培养，操作同上。

1.6 HL-60细胞中与细胞周期、增殖相关的基因mRNA检测 采用RT-PCR法。3×105细胞培养在6孔板中孵育24 h后，实验组加入1、2 μg/mL哈尔明碱作用24 h，将细胞用按照TRIzol方法提取总RNA，逆转录合成第一链cDNA，所有样品的目的基因和内参基因GAPDH进行荧光定量PCR反应，分别取得相对表达差异。PCR反应进行40个循环，94℃、90 s，56℃、30 s，72℃、60 s。各基因及其引物序列如下:基因STGC3的上游引物序列为5'-CGGGATCCATGGTTCT-TGTTTCTTAT-3'，下游引物序列为 5'-GCCCCAAGCTT-TAGAGTAATAAAAGATTC-3';基因CDK1的上游引物序列为5'-AGACCTGGGCAGATTCCAAAC-3'，下游引物序列为5'-CATGTACTGACCAGGAGGGATAG-3';基因p53的上游引物序列为5'-CGGTTTCCGTCTGGGCTTCTT-3'，下游引物序列为5'-CCACACGCAAATTTCCTTCCACTC-3';其中基因 p27的上游引物序列为5'-CCGACGATTCTTCTACTC-3'，下游引物序列为5'-CTGATAAACAAGGAAACATA-3';基因GAPDH的上游引物序列为5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物序列为5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。对照组细胞中未加入哈尔明碱进行培养，操作同上。

1.7 细胞转录因子 NF-κB和 AP-1活性检测 采用报告基因技术检测。3×105细胞培养在6孔板中孵育24 h后，转入NF-κB和AP-1荧光报告质粒孵育4 h，实验组加入1、2 μg/mL哈尔明碱作用24 h，更换新鲜无血清培养基继续孵育24 h，收集细胞，采用报告基因技术检测各处理组中转录因子NF-κB和AP-1活性。对照组细胞中未加入哈尔明碱进行培养，操作同上。

1.8 细胞因子TGF-β、IL-1β、IL-6和IL-8检测 采用ELISA技术检测。3×105细胞培养在6孔板中孵育24 h，后实验组加入1、2 μg/mL哈尔明碱作用24 h，更换新鲜无血清培养基继续孵育24 h，收集上清，采用ELISA技术检测各处理组中细胞因子TGF-β、IL-1β、IL-6和IL-8。对照组细胞中未加入哈尔明碱进行培养，操作同上。

1.9 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以±s表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组HL-60细胞增殖、周期分布比较 1、2、10、20、100 μg/mL 哈尔明碱对 HL-60 细胞的生长抑制率分别为 4.2%、9.6%、21.5%、55.3%、98.4%，随着哈尔明碱浓度逐渐增加，HL-60细胞的生长抑制率上升(P均＜0.05)。哈尔明碱对HL-60细胞周期的影响见表1。

表1 两组HL-60细胞周期分布比较(%，±s)

表1 两组HL-60细胞周期分布比较(%，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别 G0/G1期 S期 G2/M期实验组实验1 组 60.12±3.23* 20.66±1.37* 19.22±1.33*实验2 组 70.16±3.78* 19.13±1.25* 10.70±0.77*对照组46.40±2.41 25.65±1.54 27.95±1.65

2.2 两组HL-60细胞增殖相关基因蛋白、mRNA表达比较 结果见表2、3。

2.3 两组 HL-60细胞转录因子NF-κB和 AP-1活性比较 结果见表4。

2.4 两组HL-60细胞细胞因子表达比较 结果见表5。

3 讨论

肿瘤的发生、发展过程是一个多步骤、多阶段、多因素的复杂过程。研究药物抑制肿瘤细胞生长增殖的机制对于肿瘤的治疗，改善预后具有重要的意义。以往的研究［2，3］表明，哈尔明碱可抑制多种人类肿瘤，对于肿瘤治疗具有重要的意义。本研究通过观察哈尔明碱对人白血病HL-60细胞的作用，发现哈尔明碱可显著抑制肿瘤细胞的增殖，同时可以阻滞细胞周期进程，使细胞周期停滞于G0/G1期。

表2 两组HL-60细胞增殖相关基因蛋白表达比较(%，±s)

表2 两组HL-60细胞增殖相关基因蛋白表达比较(%，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别 STGC3蛋白 CDK1蛋白 p53蛋白 p27蛋白 p-AKT蛋白实验组实验1 组 147.2±11.7* 73.5±6.5* 137.6±14.7* 188.3±10.3* 53.7±4.1*实验2 组 228.3±21.6* 18.7±2.2* 197.5±24.6* 248.2±23.3* 22.6±1.2*对照组 100.0± 8.2 100.0±9.3 100.0± 7.7 100.0± 6.8 100.0±7.4

表3 两组HL-60细胞增殖相关基因mRNA表达比较(%，±s)

表3 两组HL-60细胞增殖相关基因mRNA表达比较(%，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别STGC3 mRNA CDK1 mRNA p53 mRNA p27 mRNA实验组实验1 组 166.3± 8.2* 62.5±3.5* 159.2±4.4*167.3±5.7*实验2 组 256.5±11.4* 28.9±1.7* 226.5±5.8*203.6±9.3*对照组100.0± 5.2 100.0±4.7 100.0±3.6 100.0±4.8

表4 两组HL-60细胞转录因子活性比较(%，±s)

表4 两组HL-60细胞转录因子活性比较(%，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别 NF-κB AP-1实验组实验1 组 52.7±2.2* 71.8±3.3*实验2 组 40.3±1.7* 53.4±2.6*对照组100.0±3.8 100.0±3.7

表5 两组HL-60细胞细胞因子表达比较(pg/mL，±s)

表5 两组HL-60细胞细胞因子表达比较(pg/mL，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别 TGF-β IL-1βIL-6 IL-8实验组实验1 组 277.9±32.7*269.2±24.6*548.3±47.3*239.1±18.5*实验2 组 194.8±18.5*205.7±11.7*345.7±29.6* 84.6± 8.7*对照组 413.5±57.3 371.3±31.5 877.3±82.6 457.2±51.3

本研究显示，哈尔明碱能明显促进STGC3、p53和p27的表达，下调CDK1的表达，说明哈尔明碱对肿瘤增殖的抑制作用和细胞周期的阻滞作用，可能与其可调节细胞周期相关基因有关。AKT是ILK基因重要的下游基因之一，在PI3K下游信号通路中起关键作用，调节细胞存活、分化、增殖及代谢等基本进程，能调控STGC3、p53和p27的表达，进而影响细胞周期蛋白 CDK1的表达和降解［4］。Malla等［5］发现，ILK siRNA能抑制神经胶质瘤细胞中p-AKT的表达，进而改变细胞周期进程，有效抑制细胞生长。应用ILK抑制剂(QLT-0254)能明显抑制肿瘤的生长［6］。还有研究［7］表明，通过 siRNA 条件性的敲除ILK表达，导致AKT激酶的活性几乎完全被抑制，CDK1表达受抑制，p53和p27的表达升高。

我们的实验还发现，哈尔明碱能抑制人白血病HL-60 细胞 TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎症细胞因子的分泌以及NF-κB和AP-1的转录活性。炎性细胞在肿瘤转移中发挥着重要作用，IL-6、IL-1β、IL-8等炎症细胞因子可促进肿瘤细胞增殖［8］。TGF-β可以诱导多种转录因子的表达，同时也使肿瘤细胞相关基因表达量增加，从而促进肿瘤的发生［9］。IL-6是联系炎症与癌症的重要炎性细胞因子。IL-6通过NF-κB-IL-6-STAT3级联反应在乳腺癌细胞中发挥促肿瘤的作用［10］。IL-1β则通过活化Zeb1调控肿瘤的发生［11］。在联系炎症与肿瘤的大量分子信号通路中，NF-κB和AP-1逐渐成为参与炎症诱导转移的核心分子。有证据显示，NF-κB的活化与参与肿瘤发生的许多转录因子(如 Slug、Snail、Twist以及ZEB1/ZEB2)的诱导有关［12］。

综上可见，哈尔明碱可抑制HL-60细胞的增殖能力，其机制可能与下调CDK1并上调STGC3、p27、p53 的表达，抑制细胞 TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎症细胞因子的分泌以及NF-κB和AP-1的转录活性有关。这为白血病的治疗提供了新的思路。

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