黄芩素对宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用及机制探讨

卢科莲，喻小兰，夏纪毅，毛熙光

(1泸州市妇幼保健院，四川泸州646000;2泸州市龙马潭区妇幼保健院;3泸州医学院;4泸州医学院药物与功能性食品研究中心;5泸州医学院附属医院)

宫颈癌是全球女性发病率仅次于乳腺癌的恶性肿瘤，严重影响妇女的健康［1］。宫颈癌的发生与发展、浸润与转移的过程非常复杂，其中又涉及多种基因的调控。黄芩素是中药黄芩的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化、免疫调节以及抑制肿瘤等作用［2］。Wang 等［3］发现，黄芩素可以有效抑制MDA-MB-231细胞的黏附、转移及侵袭。黄芩水提物可以明显抑制宫颈癌Hela细胞的体外生长，与药物的作用时间和浓度呈正相关［4］。2013年6～11月，我们观察了黄芩素对宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌Hela细胞株(泸州医学院附属医院医学实验中心惠赠)，DMEM高糖培养基(Hyclone公司)，黄芩素(Chengdu Must Bio-Techology公司)，细胞周期检测试剂盒(南京凯基公司)，明胶(Sigma公司)，其余SDS-PAGE胶成分(北京索莱宝公司)，5×上样缓冲液、4×上样缓冲液、考马斯蓝、脱色液、裂解液RIPA(强)及小鼠抗人β-actin抗体(碧云天公司)，蛋白酶抑制剂及磷酸化蛋白酶抑制剂(Roche公司)，兔抗人MMP-2抗体、兔抗人MMP-9抗体、兔抗人Ras抗体、兔抗人CyclinD1抗体及兔抗人Integrinβ1抗体(CST公司)，RT-PCR 试剂盒(天根公司)。MMP-2、MMP-9、Ras、细胞周期素D1(CyclinD1)及整合素β1(Integrinβ1)引物由上海生工公司合成。

1.2 细胞培养 用含有100 mL/L灭活胎牛血清及100 mol/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基培养Hela细胞。置于37℃、50 mL/L CO2细胞孵箱常规培养。

1.3 细胞分组及干预 ①取对数生长期的细胞，用2.5 g/L胰酶消化后接种到直径为10cm的一次性培养皿中(接种数量1.5×106个/皿)，等待细胞贴壁生长24 h后，换无血清DMEM高糖培养基培养同步化处理24 h，用含有不同浓度(0、100、200、300 μmol/L)黄芩素的无血清DMEM高糖培养基培养12、24、48 h。②相差显微镜下观察，与C组相比较，干预12 h时，各干预组的细胞数量、形态变化不大;干预24 h时，300 μmol/L组细胞大量死亡，病死率约90%;48 h时，各干预组细胞大量死亡，病死率80% ～90%，无实验意义，最终选择以下3组，A组加入100 μmol/L黄芩素，B组加入200 μmol/L黄芩素，C组加入不含黄芩素的无血清DMEM高糖培养基，每组设3个复孔。

1.4 细胞形态及数量变化观察 相差显微镜下观察细胞形态及数量的变化。同1.2及1.3培养细胞后，含不同终浓度(0、100、200 μmol/L)的黄芩素无血清DMEM高糖培养基培养24 h。通过显微镜观察其形态及数量的变化。为了防止其他因素的影响，实验培养3次，观察3次实验结果是否一致。

1.5 细胞周期检测 采用流式细胞技术。采用南京凯基细胞周期检测试剂盒进行检测，与细胞培养时消化细胞一致，消化细胞后，用1 mL无菌PBS重新悬浮细胞，2 000 r/min，5 min离心，小心移去上清液;加入 0.5 mL Solution Buffer轻轻悬浮细胞，2 000 r/min，5 min离心，小心移去上清液;再加入0.5 mL Solution Buffer轻轻悬浮细胞，2 000 r/min，5 min离心，小心移去上清液;加入250 μL Solution A，轻轻悬浮细胞，25℃孵育10 min;在此溶液中加入200 μL的Solution B，轻轻悬浮细胞，25℃孵育10 min;最后加入 200 μL Solution C，轻轻悬浮细胞，4℃避光10 min;上机检测(仪器为BD Verse)，记录激发波长488 nm处红色荧光。使用仪器自带专用软件成图及数据，然后进行数据的统计分析。

1.6 细胞培养基中MMP-2、MMP-9活性检测 采用明胶酶谱法。黄芩素干预24 h后，统一收集各组细胞的细胞培养基，100 μL/管进行分装，置于－80℃保存、备用。每组取12 μL上清与4 μL的4×上样缓冲液均匀混合，静置于室温10 min后，电泳。电泳结束后把胶放入含10%TRITON X-100的复性液中恢复活性2次，20 min/次;超纯水漂洗胶2次，20 min/次;加入孵育液，置于37℃水浴锅中，恒温、过夜。考马斯蓝染色1 h后，脱色2 h。胶放入Bio-Rad成像仪中成像后，Quantity One软件分析其灰度值，以条带平均光密度值(MOD)表示。

1.7 细胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。所有操作根据试剂盒操作步骤进行。Quantity One软件分析其灰度值，以条带平均光密度值表示，以β-actin平均光密度值进行标准校正。

1.8 细胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1蛋白表达检测 采用Western blotting法。宫颈癌Hela细胞用预冷、无菌PBS液冲洗3次后，加入裂解液提取总蛋白，沸水变性5 min，－20℃保存备用。10%SDS-PAGE胶电泳，电泳结束后进行转膜，时间约60 min。封闭1 h，用1×TBST轻柔漂洗5 min，一抗4℃孵育过夜(一抗 MMP-2、MMP-9稀释比例为1∶500，Ras稀释比例为1∶600，CyclinD1 稀释比例为 1∶800，Integrinβ1 稀释比例为 1∶1 000，βactin稀释比例为1∶2 000)，取出PVDF膜充分漂洗2次，20 min/次。放入二抗中(分为 HRP羊抗兔IgG(H+L)及HRP羊抗小鼠IgG(H+L)，二抗稀释比例均为1∶2 000)，室温孵育1 h。漂洗 4次，5 min/次。放入 Bio-Rad成像仪进行成像并使用Quantity One软件分析。其灰度值以条带平均光密度值表示，以β-actin平均光密度值进行标准校正。

1.9 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞数量及形态变化比较 与C组相比较，A、B组细胞数量减少，细胞形态发生变化，从不规则类圆形转变为多角梭形。

2.2 细胞周期变化比较 A、B、C组S期细胞百分比分别为 24.58%、19.41%、34.05%，G1期百分比分别为 72.67%、79.17%、64.88%，A、B 组与 C 组比较，P 均 ＜0.05。

2.3 细胞培养基中MMP-2、MMP-9活性比较 结果见表1。

表1 各组细胞培养基中MMP-2、MMP-9活性比较(±s)

表1 各组细胞培养基中MMP-2、MMP-9活性比较(±s)

注:与 C 组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01

组别 MMP-2活性 MMP-9活性A 组 32.651±0.571 33.217±0.660*B 组 28.987±1.033* 29.277±0.868△C组36.127±1.184 39.613±0.318

2.4 细胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 mRNA表达比较 结果见表2。

表 2 各组细胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 mRNA 表达比较(±s)

表 2 各组细胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 mRNA 表达比较(±s)

注:与C 组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01

组别 MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA Ras mRNA CyclinD1 mRNA Integrinβ1 mRNA A 组 1.012±0.045* 1.009±0.030*0.988±0.036*1.013±0.034* 0.983±0.036*B 组 0.849±0.026* 0.914±0.027*0.626±0.029△ 0.806±0.037△ 0.799±0.037△C 组 1.199±0.029 1.087±0.024 1.413±0.026 1.203±0.029 1.224±0.025

2.5 细胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 蛋白表达比较 结果见表3。

表 3 各组细胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 蛋白表达比较(±s)

表 3 各组细胞 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 蛋白表达比较(±s)

注:与C 组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01

组别 MMP-2蛋白 MMP-9蛋白 Ras蛋白 CyclinD1蛋白 Integrinβ1蛋白A 组 0.693±0.025* 0.886±0.032*1.127±0.028*1.061±0.028* 1.159±0.031*B 组 0.326±0.022△ 0.754±0.024*0.782±0.183*0.321±0.027△ 0.481±0.028△C 组 1.914±0.031 1.487±0.016 1.323±0.303 1.816±0.025 1.467±0.036

3 讨论

宫颈癌的发生、发展是一个缓慢的渐进过程，也是一个由多因素相互作用的连续而复杂的过程。涉及细胞无序生长、细胞外基质(ECM)被降解、原发瘤细胞突破基底膜侵入间质、瘤细胞在间质中移行并接触脉管、瘤细胞突破血管内皮及其下基底膜进入血流，并在血中存活、瘤细胞穿出血管后在组织中存活增殖，形成转移灶。所以，浸润和转移是宫颈癌疗效差、预后不良的重要因素。其侵袭和转移过程中必需穿透一系列天然组织屏障:如基底膜和ECM，合成及分泌大量基质降解酶，降解ECM是肿瘤细胞侵袭、转移的重要步骤［5］。只有完成了对ECM的降解才使肿瘤细胞突破ECM构成的结构屏障，向周围组织侵袭或进入血循环或淋巴系统［6］。

MMPs是迄今为止发现与肿瘤侵袭和转移关系最密切的一类蛋白水解酶，能降解ECM的绝大多数成分。大量研究表明，在食管癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤中MMPs的表达明显高于正常组织，而MMPs家族中以明胶酶类的MMP-2、MMP-9尤为重要，与肿瘤的侵袭和转移密切相关［7，8］。李现东［9］认为，黄芩素可以抑制肺癌细胞A549的增殖迁移并诱导其凋亡。王洪飞等［10］发现，黄芩素不但对人乳腺癌细胞株MCF-7的增殖活性具有抑制作用并促进其凋亡，它的这种作用还呈时间—剂量依赖性。

CyclinD1是细胞周期的正调节因子，跟细胞周期G1期紧密相关，其表达的增加与细胞增殖失控有关。它与细胞周期蛋白依赖性激酶结合后，促使细胞从G1期顺利进入S期，使细胞发生分裂与增殖，因此CyclinD1蛋白的过度表达会使增殖周期不断进行，导致肿瘤的发生［11］。研究［11～13］发现，在宫颈癌中 CyclinD1表达高于正常组织，在宫颈癌的发生、发展中起到重要的作用，其表达水平与临床分期、病理分级及淋巴结转移密切相关。另有研究［14，15］认为，CyclinD1基因的扩增和过表达与肝癌的侵袭性和较高的肿瘤分期有关。同时研究［16～18］显示，Ras癌基因可以通过上调CyclinD1的表达加速细胞周期的进程，同时激活的Ras信号通路使CyclinD1积聚，导致细胞进入静息状态，提示Ras诱导肿瘤发生的作用机制之一可能是通过对细胞周期素的调控改变细胞周期的进程实现的。是否Ras及CyclinD1参与了黄芩素干预宫颈癌Hela细胞增殖抑制的过程?Ras和CyclinD1之间是否仍存在相互作用关系?我们的前期实验结果表明，黄芩素干预宫颈癌Hela细胞后，将细胞阻滞于G1期，下调Ras和CyclinD1 mRNA、蛋白表达水平，与喻小兰等［19］实验结果相符。

Integrin β1在多种肿瘤细胞和实体瘤中高表达，并且与肿瘤细胞的浸润和转移密切相关，整合素的细胞内片段通过纽蛋白、辅肌蛋白、踝蛋白及整合素连接激酶与细胞骨架链接，参与细胞运动。抗Integrinβ1抗体明显抑制肿瘤细胞对胶原蛋白Ⅳ的黏附，而胶原蛋白Ⅰ、Ⅳ是ECM的重要组成部分，这提示Integrinβ1在肿瘤细胞与ECM的黏附过程中必不可少。所以研究黄芩素对宫颈癌Hela细胞的浸润、侵袭的影响，就需要研究与ECM联系紧密的Integrinβ1。

本研究显示，A、B组细胞数量较C组减少，细胞形态发生变化，从不规则类圆形转变为多角梭形，提示黄芩素可致细胞增生受到抑制，受抑制程度与黄芩素干预浓度呈正相关。A、B组S期细胞百分比较C组少，G1期百分比较C组多，提示细胞周期G1期受到阻滞，阻滞程度与黄芩素干预浓度相关。A组MMP-9活性及B组MMP-2、MMP-9活性低于C组，提示MMP-2和MMP-9活性明显受到抑制。A、B组 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1 mRNA 水平低于 C 组，提示MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1 及 Integrinβ1 mRNA 表达随黄芩素浓度的增加而降低，降低程度与黄芩素浓度相关。A、B 组 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1、Integrinβ1蛋白水平低于 C 组，提示 MMP-2、MMP-9、Ras、CyclinD1及Integrinβ1蛋白水平的表达明显受到抑制，受抑制程度与黄芩素浓度相关。

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