连翘有效成分提取及提取物对奶牛乳房炎致病菌的抑制效果

周 艳， 张 涛， 郑勤琴， 杨承霖， 樊皓月

天津农学院动物科学与动物医学学院，天津300384

连翘(Forsythia suspensa)是中国传统中药之一，又名连壳、黄花条、青翘、老翘、黄奇丹等，属木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)［1］。连翘药理作用十分的广泛，是许多中药制剂的主要原料。在临床诊疗中具有抗菌、强心、利尿、镇吐等作用，果实、叶片均可入药。连翘提取液在体外有抗菌作用，可抑制葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、白喉杆菌、痢疾杆菌及链球菌等多种革兰阳性及阴性细菌［2～4］。

奶牛乳房炎(mastitis)又称为乳腺炎，是由于奶牛的乳腺受到微生物因素、物理因素、化学因素、环境因素等因素刺激从而产生的一类炎症反应。在病因学研究方面，多数专家认为奶牛乳房炎是多病因引起的一种疾病，原发和继发细菌感染是主要病因之一［5～8］。引起奶牛乳房炎的主要致病菌包括:金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、化脓棒状杆菌、大肠杆菌类等［9］。次要病原菌包括凝固酶阴性葡萄球菌、牛棒状杆菌、表皮葡萄球菌、微球菌等［10，11］。

奶牛乳房炎对动物性食品安全与畜牧行业的发展造成了巨大的安全隐患，全球每年因乳房炎造成的损失约为350亿美元，而我国因乳房炎带来的经济损失远高于世界水平［5］。造成的损失主要包括:产奶量下降，牛奶品质低劣，牛奶废弃，由治疗、罚款、淘汰牛和丢失遗传种质等导致的费用支出。同时，乳房炎病牛乳汁中的大量病原微生物及其产生的毒素或经治疗后产生的大量抗生素残留，可直接危害人类健康，奶牛乳房炎已成为制约鲜奶加工龙头企业发展的突出问题。近几十年来，抗生素在防治奶牛乳房炎方面发挥了重要作用，但随着人们对食品安全要求的不断提高和国家对乳制品质量更严格的要求，临床治疗乳房炎常用的抗生素由于存在药物残留将逐渐被限用或禁用。并且致病菌对抗生素产生了抗药性和耐药性［7，12］，也是治疗工作的重大障碍。

鉴于抗生素类化学合成药物存在诱发细菌产生抗药性的弊端以及抗生素残留引发的食品安全问题，中草药天然抗菌制剂因其含有多种生物有效成分，不易产生细菌耐药性、低毒、低残留或无残留，还可以提供微量元素等特点［13～18］，已日益为国内外专家所关注。应用中药治疗奶牛乳房炎，连翘是其中的代表之一［2］。

本研究结合天津本地植物资源情况，从本地草药资源中选取连翘，提取浸提物，对本地牛场中乳房炎牛乳液中分离、纯化、复壮后得到的几种致病菌，进行抑制试验，为奶牛乳房炎的治疗提供中草药抑制奶牛乳房炎致病菌方面的科学依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

连翘叶片于2014年4月采自天津农学院园艺苗圃内，保存于本实验室4℃冰箱中。

罹患乳房炎奶牛乳样采集:乳样主要采自某奶牛场3个牛群，共采集40个样本，所选牛只均有明显症状。牛只按常规挤奶消毒后，再用酒精棉球消毒乳头和采样者手指。每个乳头挤去头2～3滴，取乳后无菌乳样约5mL，盛于灭菌青霉素瓶内贴好标签，便携冰盒保存，并于4 h内置4℃冰箱存放。

1.2 培养基

细菌培养基:牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，固体培养基加琼脂 20 g/L，pH 6.4。121℃，灭菌 15min。

真菌培养基:牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L，121℃，灭菌 20min。

1.3 主要试剂与仪器

连翘苷标准对照品(新乡博凯生物技术有限公司);十八烷基硅烷键合硅胶(欧瑞SA-3，天津欧瑞生物科技有限公司);高效液相色谱仪(Laballiance WA2002SF，美国 Laballiance公司)。

1.4 连翘叶片有效成分的提取

取25 g叶片，冰浴研钵研磨成粉末备用。对连翘叶片粉末进行有效成分提取，步骤如下:

①取连翘叶片粉末1 g，加70%乙醇10mL热浸，浸出液蒸干。残渣以1mL冰醋酸溶解后，倾入小试管，沿管壁加人硫酸1mL，两液层间出现紫红色环。②取紫红色液层，加乙醚5mL，振摇5min，滤过，滤液置小试管中，加7%盐酸羟胺甲醇溶液3滴，20%KOH-甲醇溶液3滴，于水浴中微热2min，放冷，加1%HCl，使呈微酸性，再加1%FeCl3-乙醇溶液2滴，呈紫红色。取该紫红色液层蒸干，残渣留存。多次操作获得足量残渣。③称取残渣约1 g，在锥形瓶内加甲醇15mL，塞严防止挥发。浸提24 h，超声25min，冷却，称重，加甲醇溶剂补充至原初重量，混匀，过滤，量取过滤液5mL，蒸发至近干，中性氧化铝0.5 g拌匀，通过中性氧化铝柱(100～120目，内径1～1.5cm，1 g)，加80mL 70%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸发至全干，通过这种回流热浸提法，多次操作获取连翘叶片提取物粉末，4℃保存备用。

1.5 连翘叶片提取液有效成分的测定

1.5.1 薄层色谱测定 取连翘叶片提取物粉末3 g，加水20mL，煎煮 30min，加 6 mol/L HCl，调pH至2.0，即用乙醚20mL提取，回收乙醚提取后的残渣，再溶于乙醇0.5mL中，作为待测样品溶液。另取连翘苷标准对照品配制成参照标样溶液。吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶H1%CMC薄层板上，以氯仿－甲醇(20∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%H2SO4，110℃烤10min。

1.5.2 高效液相色谱法测定 色谱条件:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:乙腈 －水(25∶75);流速:1.2mL/min:检测波长:277 nm;柱温:30℃;进样量:10 μL。参照标准样品为连翘苷标准对照品，以甲醇梯度稀释配制标准溶液。

1.6 奶牛乳房炎致病菌的获得

将乳样分别划线接种于细菌培养基和真菌培养基，置37℃温箱培养24 h后观察菌落形态特征，提取典型菌落涂片，革兰氏染色，镜检。根据菌体形态及染色特性初步判定细菌类属，并将其进一步纯化培养［6，19］。

1.7 梯度浓度的连翘提取物溶液抑菌试验

1.7.1 梯度浓度连翘提取物溶液的制备 称取按1.4中方法得到的连翘叶片提取物，以甲醇为溶剂，制成浓度为 0.002 g/L、0.02 g/L、0.2 g/L的溶液。

1.7.2 抑菌试验 多种致病菌4℃保存，对致病菌进行复壮、培养，菌株培养24 h，形成菌苔。分别按1.7.1中的浓度梯度进行连翘提取物抑菌效果试验。以溶剂甲醇为空白对照。观察48 h内提取物溶液对菌苔的抑制效果。

2 结果与分析

2.1 连翘有效成分的提取与纯度测定

对连翘叶片采用回流法工艺，采用不同的有机溶剂进行浸提。薄层色谱分析结果，待测样品在与参照标样色谱条带相应的位置上，显示相同的灰黑色斑点(见图1)，表明本实验所用方法提取物质为连翘苷。

高效液相色谱法测定结果显示连翘叶片粉末提取物有效成分主要为连翘苷，连翘苷标准品在同样色谱条件下测定以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果显示在0.157～1.57 μg/mL浓度范围内呈良好的线性相关。测得连翘叶片粉末提取物中连翘苷的含量为0.13%，获得较好的提取纯度。

图1 连翘提取物成分薄层色谱分析图Fig.1 TLC analysis on the component of Forsythia suspensa extract.

2.2 奶牛乳房炎致病菌的分离、鉴定

采用划线法、单株菌落培养分离奶牛乳房炎致病菌，鉴定后发现多数致病菌为细菌，主要是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌。真菌为曲霉。

2.3 抑菌效果

梯度浓度的连翘叶片提取物溶液对菌苔均有不同程度的抑制效果(见图2，彩图见封三图版)。0.02 g/L(标记为“Z”)的提取液出现了明显的抑菌斑，抑菌斑半径较大，观察结束(48 h)后仍有继续扩大的趋势。浓度0.2 g/L(标记为“G”)、0.002 g/L(标记为“D”)的连翘提取液的抑菌作用并不显著，0.2 g/L提取液表现为形成的抑菌斑深而小，边缘清晰，无扩散趋势，但是抑菌斑外残留了较宽的菌环。0.002 g/L提取液形成的抑菌斑较浅，边缘不明显。对于金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌，抑菌圈的边缘比较清晰，抑菌圈深度较深，在观察结束(48 h)后有持续扩大趋势，对于枯草杆菌，抑菌圈边缘比较模糊，深度较浅，观察接近结束已经无扩大的趋势，并且已经开始变浅。可见，连翘提取液能够抑制牛乳房炎致病菌，不同浓度的连翘提取液对供试致病菌样本具有不同程度的抑制作用，并非浓度越高抑菌效果越好;对于不同致病菌的抑制效果也不尽相同。

图2 梯度浓度连翘提取物溶液抑菌效果Fig.2 Bacterium inhibitory effect of Forsythia suspensa extract solution with different concentration.

3 讨论

奶牛乳房炎是多因素综合造成的危害奶牛业的常见疾病之一，也是一个世界性奶牛业问题，虽然治疗方法众多［20，21］，但仍未有一种方法能够对乳房炎药到病除。中药制剂在此方面有显著优势［22］，亟待开发利用。我国盛产连翘，以中医药理论为指导，还需结合现代科学技术手段，以加快奶牛乳房炎的致病机理与防治的研究。连翘浓缩煎剂在体外有抗菌作用，可抑制伤寒杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌等，提示连翘抗菌有效成分提取可采用热浸法。连翘的化学成分复杂，生物活性多样，而连翘叶化学成分和药理作用研究还比较少，相对而言，其主要有效成分连翘苷类物质研究较多。本研究采用热浸回流法提取连翘有效成分，鉴定获得有效成分连翘苷，并测定其连翘苷含量确定提取物纯度，以明确连翘提取物对奶牛乳房炎病原菌的抑制作用。无论临床型还是隐性奶牛乳房炎［23，24］，其在临床表现症状都是炎性反应。炎症是乳腺损伤和产奶量下降的直接原因［25］。中药能够直接作用于病原微生物，抑制其生长繁殖或杀灭病原微生物，从而达到缓解临床症状、防治疾病的目的［9］。所以在研究中药治疗奶牛乳房炎的机理时，中药制剂的抗菌活性是一项重要的指标［9，26］。采用连翘提取液对引起奶牛乳房炎的致病菌进行敏感性试验，验证了中药连翘的抑菌抗炎作用，为其治疗奶牛乳房炎提供了有力的依据。

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