RAPD及SRAP两种分子标记技术对苦瓜杂交种纯度的鉴定分析

张少平， 张玉灿，2*， 张伟光， 赖正锋， 郑云云， 陈玉水

1.福建省农业科学院闽台园艺研究中心，福建漳州363005;

2.福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州350003;

3.福建省农业科学院，福州350003

苦瓜(Momordica charantia L.)是盛夏时期长江以南地区的重要蔬菜，其清爽解暑、营养丰富、且含有多种人体必需的微量元素，是典型的药食同源瓜类蔬菜［1］。近年来，苦瓜在我国的商品化种植面积逐年扩大，已成为一种较有发展前景的经济作物。福建省是苦瓜的主产区之一，年播种面积约1.5万hm2。苦瓜杂种优势明显，所以目前苦瓜商品化种植所需种子一般都为F1代杂交种。近年来，我国很多地方都加大了苦瓜新品种的引进及选育，苦瓜新品种推陈出新的速度较快。因此，对育成品种进行快速鉴定及保护具有十分重要的现实意义，以往形态特征鉴别苦瓜种质和鉴定杂交种纯度具有很大的局限性，而分子标记技术具有直观、方便、快速及成本低等特点，已被越来越普遍地应用于许多植物品种的鉴别及指纹图谱的构建［2～6］。苦瓜品种的分子鉴别也有一些报道［7～10］。本研究以苦瓜杂交种如玉11号及其亲本为材料，采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)及相关序列扩增多态性(sequence—related amplified polymorphism，SRAP)两种分子标记技术，通过前期引物筛选及反复验证，建立了如玉11号苦瓜F1代杂交种纯度分子鉴定的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苦瓜杂交种为如玉11号(审定编号:闽认菜2010002)，母本BAL-22-31是由日本“群星”苦瓜经过多代自交纯化而成的自交系，父本9208B是由福建漳平“西园”苦瓜经多代纯化而成的自交系，上述材料均由福建省农业科学院农业生物资源研究所提供。Taq酶、dNTPs、琼脂糖以及合成RAPD引物及SRAP引物等均购自生工(上海)生物技术有限公司;其他常规试剂均购自漳州市翠林化玻仪器有限公司。

1.2 试验方法

1 2.1 不同苦瓜基因组DNA的提取 以上述三种苦瓜幼苗嫩叶作为试验材料，采用改良的CTAB法［11］提取其总DNA，用紫外分光光度计在260 nm和280 nm下测定其OD值，检测DNA的浓度及质量，并稀释至30 ng/μL左右，－20℃保存备用。

1.2.2 RAPD及SRAP多态性引物设计与筛选根据目前在苦瓜上已报道的46个有效RAPD引物设计合成 RAPD 引物［12～16］(见表1);根据SPAP引物设计原理合成22条引物，随机组合成121对SRAP引物(见表2)。使用上述3种苦瓜的混合DNA对121对引物进行预筛选，筛选背景和扩增条带都比较清晰的SRAP引物。使用全部121对SRAP引物和46个RAPD引物进行PCR扩增，分析差异条带，筛选出现差异条带的引物。对筛选到的出现特异条带的RAPD及SRAP引物，再次进行重复验证(重复提取3次DNA，以其为模板进行5次RAPD-PCR和SRAPPCR重复实验)，以获得稳定重复差异条带的RAPD及SRAP引物。

表1 本研究中应用的46个RAPD引物Table 1 46 RAPD primers used in this study.

表2 本研究应用的121对SRAP引物序列Table 2 121 SRAP primers used in this study.

1.2.3 RAPD及 SRAP扩增 RAPD及 SRAP扩增反应均在PCR仪上完成。RAPD-PCR反应体系(20 μL)为:Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTPs(2.5mmol/L)1.6 μL，DNA模板 0.5 μL，扩增引物(10 μmmol/L)4 μL，加ddH2O至20 μL。RAPD扩增程序为:95℃ 3min;94℃ 1min，36℃ 1min，72℃ 2min，45 个循环;72℃ 5min。于4℃保存或直接电泳检测。SRAPPCR 反应体系(20 μL)为:Taq DNA 酶(5 U/μL)0.2 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTPs(2.5mmol/L)1.6 μL，DNA 模板 0.5 μL，10 μmmol/L 的上下游引物各 4 μL，加 ddH2O 至 20 μL。SRAP 扩增程序为:95℃ 3min;94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 1min，5 个循环;94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，35个循环;72℃ 10min。于4℃保存或直接电泳检测。

1.2.4 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析 所得RAPD-PCR及SRAP-PCR扩增产物每管加入约3 μL 6 ×PCR loading buffer，其中 RAPD-PCR 产物用1.5%、SRAP-PCR产物用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，电压为8 V/cm，电泳1.5 h后EB染色，紫外灯下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 三种苦瓜基因组DNA提取结果分析

本试验采用改良的CTAB法提取如玉11号及其亲本苦瓜新鲜嫩叶片总DNA，通过测定其OD值及检测DNA浓度和质量，发现该3种苦瓜DNA提取的含量均较高，且总DNA中多酚类化合物及多糖等污染物均去除的较为干净，DNA完整性也较好(见图1)，适于下一步RAPD及SRAP多态性分析。

图1 三种苦瓜总DNA提取电泳图Fig.1 Electrophoresis of genome DNA of 3 bitter gourds.

2.2 RAPD多态性引物筛选

采用已报道的46个RAPD引物对苦瓜F1代杂交种及其亲本基因组DNA进行PCR扩增，重复试验结果显示，46对RAPD引物均未获得如玉11号苦瓜杂交种及其亲本共显性条带，也未获得父本特异标记引物，仅1个引物R5产生了母本特异标记条带(见图2)。利用R5引物可以区分如玉11苦瓜杂交种与其母本种子。

图2 引物R5扩增图谱Fig.2 RAPD-PCR results using primer R5.

2.3 SRAP多态性引物筛选

采用121对SRAP引物进行如玉11苦瓜及其亲本混合DNA预筛选扩增，其中20对引物扩增结果背景清晰、条带数量少且清楚，编号分别为:Me1-Em1、Me1-Em4、Me1-Em9、Me2-Em4、Me2-Em5、Me2-Em8、Me3-Em2、Me3-Em8、Me4-Em9、Me4-Em10、Me5-Em4、Me5-Em5、Me5-Em9、Me6-Em1、Me6-Em2、Me6-Em10、Me7-Em1、Me7-Em8、Me7-Em9和Me8-Em10，利用这20对引物进行3种苦瓜差异片段扩增试验，结果发现，这20对SRAP引物在3种不同苦瓜中扩增出完全相同的条带。因此重新利用其余的101对引物再次进行SRAP扩增。结果发现，1对引物(编号Me1-Em6)产生了母本特异标记(见图3)。

图3 引物Me1－Em6扩增图谱Fig.3 SRAP-PCR results using primer Me1-Em6.

2.4 如玉11号苦瓜杂交种子纯度的检测

挑选190粒如玉11号F1代种子及10粒其母本种子，标记后同时播种于穴盘育苗，待幼苗长至2片真叶时，每株分别采取半片叶按1.2.1方法提取DNA，分别用RAPD技术(引物R5)及SRAP技术(引物Me1-Em6)进行分子鉴定。结果发现，RAPD-PCR(见图4)及 SRAP-PCR(见图5)扩增产物电泳后条带结果与前期筛选的结果完全吻合，且重复性好。其中7号和11号种子出现母本特异条带，鉴定为假杂交种，两种技术的检测结果一致。说明应用上述引物，RAPD和SRAP技术都可用于识别由苦瓜母本植株自花授粉而产生的假杂交种。

图4 RAPD-PCR检测种子纯度Fig.4 Seed purity identification by RAPD-PCR.

图5 SRAP-PCR检测种子纯度Fig.5 Seed purity identification by SRAP-PCR.

3 讨论

杂交种子纯度的分子鉴定一般采用一对双亲互补型引物进行PCR扩增，或者采用偏父及偏母型引物组合的交叉验证法［3，11］。然而本试验同时采用RAPD和SRAP两种分子标记技术进行如玉11号苦瓜及其亲本PCR扩增时，均只扩增出由一组引物产生的母本特异标记。理论上，该母本特异标记不能直接运用于苦瓜如玉11号种子纯度的鉴定，然而在苦瓜杂交育种的实际生产运用中，在辨别该杂交种是否由其父母本杂交而来时，最容易发生混杂的假杂交种子是来自于母本植株的自花授粉，而本试验RAPD及SRAP结果均获得一个母本特异型标记引物，这对苦瓜如玉11号种子纯度的分子鉴定具有非常现实的意义。

RAPD-PCR扩增产物一般采用琼脂糖凝胶介质进行分离，而SRAP-PCR扩增产物可采用琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶两种不同介质进行分离。一般来说，聚丙烯酰胺凝胶电泳操作过程更为繁琐，且其显示出的PCR产物扩增条带繁多且复杂，这将给种子纯度鉴定带来很多不便。而琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物操作简单、特异性条带清晰、实际操作过程中易于辨别，因此本试验采用了琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，RAPD-PCR试验结果的琼脂糖凝胶电泳背景条带较SRAPPCR试验结果更清楚，说明这与DNA模板质量无关，可能是因为Me1-Em6引物特异性不是很强，但该引物检测结果的稳定性和重复性均很好，因此不影响如玉11号苦瓜种子纯度的SRAP分子检测。

本研究根据近年来在苦瓜上报道有效的RAPD引物共计46个，以及根据SRAP引物设计原理，随机设计121对引物，进行如玉11号苦瓜及其父母本差异基因筛选。从大量的试验操作过程看，RAPD分子标记只需1个引物，因此操作起来较SRAP分子标记相对简单，但在引物设计方面，因SRAP引物是两两配对而来，所以只需设计较少的引物就可以形成较多引物对进行筛选试验，同时，RAPD分子标记开发较SRAP分子标记更早，其应用于苦瓜遗传多用性分析及种子纯度鉴定等较SRAP更多，因此在苦瓜上开发的较多的RAPD分子标记引物，理论上可借鉴并用于如玉11号等苦瓜种子的纯度鉴定，然而本试验表明，其他苦瓜上已开发的RAPD标记引物对如玉11号苦瓜种子纯度鉴定参考价值不高，此两种分子标记结果也都只获得一个母本特异标记引物，说明如玉11号苦瓜F1代杂交种与其亲本(尤其是父本)基因组DNA序列相似程度极高，这与张少平等［7］对新翠苦瓜种子纯度的RAPD分子检测结果相吻合，也符合刘爱群等［17］对分子标记鉴定葫芦科瓜类作物种子纯度的研究进展所做的总结。因此，此结果进一步表明，要完全通过分子手段鉴定出如玉11号苦瓜F1代杂交种纯度及对其新品种保护，除了需要选择合适的分子标记外，还需要设计足够多的引物，只有这样才有可能获得有效且最佳的双亲互补型引物来建立苦瓜杂交种种子的分子水平质量控制系统。

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