球松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用*

杨 艳

(泰山医学院，山东 泰安 271000)

动脉粥样硬化疾病始发于动脉内膜损伤，而血管内皮功能紊乱也被认为是动脉粥样硬化的最早期表现[1]。蜂胶是蜜蜂生产的天然绿色物质，具有多种医疗保健作用。研究表明[2，3]，蜂胶水提取液及黄酮类化合物具有抗炎、抗病毒、提高机体免疫力等多种医疗保健作用，并具有保护血管内皮细胞，防治动脉粥样硬化的功能。球松素是蜂胶黄酮类化合物中含量较高的单体之一。本实验采用脂多糖(LPS)诱导活化体外培养的的人脐静脉内皮细胞，建立血管内皮细胞损伤模型，探讨球松素对损伤血管内皮细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验材料 新生儿脐带(出生1 h内)：由泰安市中心医院产科提供。

1.2药品与试剂 球松素 (≥99.0%TLC)、脂多糖(From Escherichia coli 055：B5)、MTT粉剂、DMSO(购自美国Sigma公司)，I型胶原酶、胰蛋白酶、DMEM/F12培养基、特级胎牛血清(FCS)(购自美国Gibco公司)，PBS、D-Hank’s缓冲液由实验室配制，抗人Ⅷ因子抗体一抗(购自中杉生物技术开发有限公司)，NO含量测定试剂盒(购自上海太阳生物技术有限公司)，SABC免疫组化试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)，细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3仪器与设备 SW-CJ-2FD超净工作台(苏州净化设备有限公司)；TMQ.R-3250自动台式灭菌器(新华医疗器械股份有限公司)；SANYO MCO-15AC CO2培养箱(日本SANYO公司)；酶标仪(BIO-RAD产品)；IX51倒置式基础型显微镜及Image-ProPlus-Version 4.0 for windows?图像处理系统(日本OLYMPUS公司)；M-3100型原子吸收-分光光度计(美国PE公司)。

1.4实验方法

1.4.1人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定 根据Jaffe[4]的方法并加以改进。取出生1h内新生儿脐带(长度>15 cm)，用0.1%Ⅰ型胶原酶对脐静脉内皮进行灌注消化，以含20% FCS的DMEM/F12培养，细胞融合生长至80%～90%时传代。选取第2～3代内皮细胞用于实验。倒置显微镜下观察，细胞呈短梭形或多角形且呈典型的铺路石状排列。Factor VIII 相关抗原免疫组织化学染色法鉴定95%以上细胞呈阳性表达。

1.4.2实验分组 按密度5×104个/ml将细胞接种于96孔培养板中，培养24 h，更换含5%FCS的DMEM/F12培养基继续培养24h。实验分阴性对照组(D-Hank`s液)、模型组(D-Hank`s液+LPS100μg/L)和不同浓度球松素组(模型组基础上分别加入50、100、200 mg/L的球松素干预)，每组设6个复孔，培养24 h，观察细胞形态。

1.4.3MTT比色法测定人脐静脉内皮细胞活性 上述各组细胞中每孔加入10μl MTT溶液(5g/L)，孵育4h，吸出孔内培养液，每孔加入100 μl DMSO，振荡混匀30 min，使结晶完全溶解；以λ=490 nm，全自动酶标仪上检测各孔OD值。

1.4.4ELISA法检测细胞上清液中NO含量 方法按试剂盒说明操作，借助分光光度计的光吸收(λ=450nm)计算细胞上清液中NO含量(μmol/L)。

1.4.5TUNEL法检测细胞凋亡 按TUNEL试剂盒说明操作，Image-Pro Plus-Version 4.0 for windows图像处理系统测定凋亡细胞百分比(%)。

2 结 果

2.1人脐静脉内皮细胞形态观察及鉴定 倒置显微镜下观察，细胞呈梭形或多角形，排列紧密，呈“铺路石”样；Factor VIII 相关抗原免疫组织化学染色法检测发现，95%以上细胞呈阳性表达，阳性细胞胞浆内可见大量棕黄色颗粒。

2.2球松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞形态学的影响 倒置显微镜下观察，阴性对照组细胞呈梭形或多角形，紧密贴壁，单层铺路石状镶嵌排列。模型组可见细胞收缩变圆，细胞间隙增宽，核浓缩，尚有部分细胞脱落；球松素组见细胞间隙变窄，形态趋于正常。

2.3球松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞活性的影响 与对照组比较，模型组HUVEC活性明显降低(P<0.05)。各浓度球松素组均可抑制脂多糖的作用， 100 mg/L及200 mg/L球松素组与模型组相比，内皮活性明显增强，且随球松素浓度的增加细胞活性而有增强的趋势。见表1。

表1 球松素对脂多糖诱导的HUVEC活性的影响(s，n=6)

▲P﹤0.05 vs模型组。

2.5球松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞分泌NO的影响 模型组与对照组相比，NO分泌量均明显降低(P<0.01)；球松素各浓度组与模型组相比，NO分泌增强；且NO分泌量随球松素浓度的增加而有增强的趋势，见表2。

表2 球松素对脂多糖诱导的HUVEC分泌NO活性的影响(μmol/L ，s，n=6)

▲P﹤0.01 vs 模型组

2.6球松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

模型组与对照组相比，脂多糖能明显诱导内皮细胞凋亡的发生(P<0.05)。100 mg/L及200 mg/L球松素组与模型组比，能明显降低细胞凋亡的发生(P<0.05)，细胞凋亡率的降低随球松素浓度的增加而有增强的趋势，见表3。

表3 球松素对脂多糖诱导的HUVEC凋亡的影响(%，s，n=6)

▲P﹤0.01 vs模型组

3 讨 论

近年来，以动脉粥样硬化为基础的心脑血管疾病的发病率逐年上升，对其发病机理及预防治疗的研究也成为人们关心的热点。动脉粥样硬化是在各种损伤因素的刺激下，动脉壁发生的慢性炎症-增殖性反应。 RossR教授[5]在损伤反应学说的基础上，明确提出炎症反应始终伴随着动脉粥样硬化的发生发展；而血管内皮细胞的形态与功能改变则被认为是动脉粥样硬化的初始环节。LPS作为炎性刺激因子，可通过直接或间接损伤两条途径作用于血管内皮细胞[6],引起血管内皮细胞形态及功能的改变，并抑制血管内皮细胞NO的合成释放，从而促进动脉粥样硬化的发生发展[7]。尚有研究表明，血管内皮细胞的凋亡也参与了动脉粥样硬化斑块的形成，加速了动脉粥样硬化的进程[8]。

本次实验采用脂多糖诱导活化体外培养的人脐静脉内皮细胞，建立血管内皮细胞炎性损伤模型，并用球松素加以干预，观察球松素对人脐静脉内皮细胞的影响，探讨球松素对血管内皮细胞可能的保护作用。结果发现，脂多糖可明显降低人脐静脉内皮细胞活性，抑制血管内皮NO的合成及释放，并显著诱导内皮细胞凋亡的发生；3种浓度球松素均可显著增强人脐静脉内皮细胞的活性，促进NO的分泌，并部分改善脂多糖诱导的内皮细胞凋亡，具有一定的浓度依赖趋势，说明球松素可通过减少脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，抑制内皮细胞损伤，从而保护血管内皮。目前蜂胶总黄酮的研究探讨较多，而黄酮单体的研究甚少。通过分离鉴定蜂胶黄酮的有效成分，寻找具有活性的化学单体，对进一步开发利用蜂胶资源及阐明蜂胶防治动脉粥样硬化的相关物质基础具有重要的意义。

[1] Dimmeler S，Hermann C，Zeiher AM. Apoptosis of endothelial cells.Contribution to the pathophysiology of atherosclerosis[J]. Eur Cytukine Netw，1998，9：697-698.

[2] 张云香，冯春梅，王家富. 蜂胶水提液对TNF-α诱导的血管内皮细胞凋亡的影响[J]. 中国动脉硬化杂志，2005，13 (专辑)：81.

[3] 李东娟，王家富，李伟. 蜂胶乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞的保护作用[J]. 中国组织工程研究与临床康，2007，11(41)：8318-8320.

[4] Jaffe EA，Nachman RL，Becher CG，et al. Culture of human endothelial cells drived from umbilical veins [J]. Clin Invest，1973，52(11)：2745-2756.

[5] Ross R. Athrosclerosis: an inflammatory disease[J]. N Engl Med，1999，340(2)：115-126.

[6] Reichlin T，Wild A，Durrenberger M，et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy[J]. Struct Biol ，2005，152 (1)：52-63.

[7] Cusack MR，Marber MS，LambiAse PD，et al. Systemic inflammation in unstable angina is the result of myocardial necrosis[J]. Am Coll Cardiol，2002，39(1)： 917-923.

[8] 李伟，李冬娟，杨艳. 乔松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响[J]. 中国动脉硬化杂志，2010，18 (5)：351-354.