捏脊疗法对颈椎病模型大鼠纤维环细胞影响的实验研究*

廖 军，谢巧瑜，张 乐，郑佳璇，柯玫瑰，黄萍萍

(1.福建中医药大学针灸学院，福州 350122;2.厦门市第二医院海沧分院康复理疗科，厦门 361026)

随着现代生活方式改变，颈椎病发病率逐年升高，其发生发展的根本原因为颈椎间盘退变[1]。大多认为，椎间盘细胞外基质的降解与基质黏附功能减弱导致的细胞凋亡是导致颈椎间盘退变的两个重要因素[2]。一方面，基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)是降解细胞外基质的重要蛋白酶，在椎间盘退变中起重要作用，其中的基质金属蛋白酶-l(MMP-1)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)在椎间盘退变中起关键作用[3];另一方面，细胞外信号调节蛋白激酶 (Extracellular signal regulated protein kinase，ERK1/2)可促进细胞增殖信号的传导，故激活ERK1/2信号通路可促进细胞增殖、分化及抑制细胞凋亡等[4]。此外，ERK1/2信号传导通路的激活往往可伴有另一通路PI3K-Akt信号通路的激活[5]。蛋白激酶 B(Protein kinaseB，Akt)在细胞存活和凋亡中起重要作用，故Akt、ERK1/2可对椎间盘纤维环细胞的生长修复及凋亡有重要影响。对颈椎病的治疗西医主要有手术治疗和西药的抗炎镇痛治疗，但手术影响颈椎结构稳定性，且费用高、创伤大、西药治疗副作用多等因素，传统中医疗法治疗颈椎病疗效公认，捏脊疗法治疗该病显示出较好疗效[6]。本文研究捏脊疗法对颈椎间盘纤维环细胞影响及其机制具有重要意义。

1 材料

1.1 实验动物及分组

SPF级SD大鼠24只，体质量(180±10)g，雌雄各半，按随机数字表法分成空白组、模型组、捏脊组、莫比可组，每组6只。动物由福建中医药大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及仪器

一抗(MMP-1、MMP-3、ERK1/2、Akt抗体)试剂盒、免疫组化SABC试剂盒(内含二抗试剂盒、DAB显色剂、APES防脱片试剂)，以上试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司，美洛昔康片，购自扬子江药业集团有限公司(批号H12030241)，切片机、恒温干燥箱、石蜡包埋机。

2 方法

2.1 实验造模

建立动静力失衡颈椎病模型，依据王拥军等[7]实验造模。模型组大鼠称重腹腔麻醉后，在大鼠右侧耳后项背部将鼠毛剔除，常规消毒，然后在大鼠项背部正中纵向切开长度2 cm左右的切口，再将深群颈夹肌和头、颈、寰最长肌横向切断，切除颈髂肋肌与头半棘肌，再依次切除右棘上和棘间韧带，最后缝合。捏脊组、莫比可组造模方法同模型组。空白组仅消毒切开皮肤后缝合。造模后同等条件、相同时间下饲养2个月。通过HE染色，光学显微镜下观察椎间盘组织形态学情况:空白组颈椎间盘的髓核四周环绕着纤维环组织且紧密排列，界限清楚;纤维环软骨结构清晰可辨，软骨细胞排列整齐，未见炎性细胞浸润。模型组髓核出现皱缩，髓核与纤维环间的界限较模糊，髓核有外突趋势，纤维环软骨层纤维部分出现肿胀甚至断裂，胶原纤维毛糙，软骨细胞有退行性改变[8]，确定造模成功。

2.2 治疗方法

捏脊组造模后将大鼠用自制的松紧带固定，每日进行1次捏脊治疗。捏脊手法:一手固定大鼠，另一手的拇指与食指指腹相对用力，轻轻提起大鼠脊柱两侧皮肤，从脊中线尾根部一直捏至大椎穴处1次共14次。从第7次开始双手十指齐捏脊柱两侧皮肤并捏三提一，从尾根部至大椎穴，力量以大鼠不尖叫且较平静为度。操作中涉及的穴位按《实验针灸学》(李忠仁主编，中国中医药出版社出版)比照人体穴位选取[9]。每日1次，连续14 d为1个疗程，间隔2 d后开始下个疗程，共2个疗程。

莫比可组造模固定后给予莫比可灌胃治疗，按照《动物实验方法学》[10]人与大鼠体表面积的药物等效剂量换算为:大鼠的剂量=人的剂量×(90/100)×(人的体质量/大鼠的体质量)1/3。每日1次，连续14 d为1个疗程，疗程同捏脊组。空白组、模型组大鼠均固定而不做其他任何处理，治疗时间及疗程同捏脊组。

2.3 免疫组化检测

将SD大鼠麻醉处死后于冰袋上快速依次取下各节椎间盘软骨组织，用PBS清洗2遍，放入4%多聚甲醛液固定、脱钙、脱水、石蜡包埋后进行免疫组化操作:先脱蜡，常规处理至水，于3%H2O2室温孵育8 min。在0.01 mol/L柠檬酸缓冲液中，微波炉加热至沸腾后将组织放入闷10 min取出，室温冷却后用蒸馏水洗1次，PBS洗5 min×3次，再用BSA封闭10 min，稀释一抗，4℃过夜，将组织取出室温复温1 h后，PBS洗3 min×3次，滴加生物素标记的二抗室温孵育20 min，PBS洗5 min×3次;滴加试剂SABC20 min，PBS洗3 min×3次;DAB显色液显色5 min，显微镜下观察。阳性细胞表达为棕黄色或棕褐色颗粒，每组随机取5只大鼠，每只1张切片，每张切片取400倍视野5个，记录其阳性表达细胞数取均值，最后蒸馏水洗，未复染，脱水、透明、封片。

2.4 统计学方法

应用SPSS 16.0软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差(s)表示，各组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 颈椎间盘纤维环细胞MMP-1、MMP-3免疫组化的检测结果

颈椎间盘纤维环细胞MMP-1染色结果显示，空白组染色较浅，多呈弱阳性或阴性表达，阳性表达较少(见图1);模型组大鼠颈椎间盘纤维环细胞染色普遍较深，黄色、棕褐色较多见，多呈阳性表达(见图2);捏脊组、莫比可组多呈阳性或弱阳性(见图3、图4)。MMP-3蛋白表达:在空白组阳性反应细胞数量较模型组明显较少(见图5、6);捏脊组、莫比可组阳性细胞数量均较模型组少(见图7、8)。表1显示，模型组MMP-1、MMP-3阳性细胞数明显高于空白组，差异有统计学意义(P＜0.05);捏脊组与模型组比较，MMP-1、MMP-3蛋白阳性细胞数明显降低，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，提示捏脊疗法可降低MMP-1、MMP-3蛋白表达。

表1 大鼠颈椎间盘纤维环细胞MMP-1、MMP-3、ERK1/2、Akt蛋白表达结果(s)

表1 大鼠颈椎间盘纤维环细胞MMP-1、MMP-3、ERK1/2、Akt蛋白表达结果(s)

注:与模型组比较:△P ＜0.05

组别 例数MMP-1 MMP-3 ERK1/2 Akt空 白 组 6 24.17±5.23△ 15.50±6.8△ 65.83±14.95△ 96.00±17.02△模 型 组 6 53.3±12.11 49.33±6.64 34.83±11.25 65.50±16.54捏 脊 组 6 26.33±4.89△ 16.17±5.67△ 56.50±18.44△ 88.33±15.77△莫 比 可 组 6 25.33±8.82△ 16.83±6.85△ 58.33±23.54△ 89.67±20.49△

图1 空白组颈椎间盘纤维环细胞(MMP-1的免疫组化表达，×400)

图2 模型组颈椎间盘纤维环细胞(MMP-1的免疫组化表达，×400)

图3 捏脊组颈椎间盘纤维环细胞(MMP-1的免疫组化表达，×400)

图4 莫比可组颈椎间盘纤维环细胞(MMP-1的免疫组化表达，×400)

图5 空白组颈椎间盘纤维环细胞(MMP-3的免疫组化表达，×400)

图6 模型组颈椎间盘纤维环细胞(MMP-3的免疫组化表达，×400)

图7 捏脊组颈椎间盘纤维环细胞(MMP-3的免疫组化表达，×400)

图8 莫比可组模型组颈椎间盘纤维环细胞(MMP-3的免疫组化表达，×400)

图9 空白组颈椎间盘纤维环细胞(ERK1/2的免疫组化表达，×400)

图10 模型组颈椎间盘纤维环细胞(ERK1/2的免疫组化表达，×400)

图11 捏脊组颈椎间盘纤维环细胞(ERK1/2的免疫组化表达，×400)

图12 莫比可组颈椎间盘纤维环细胞(ERK1/2的免疫组化表达，×400)

图13 空白组颈椎间盘纤维环细胞(Akt的免疫组化表达，×400)

图14 模型组颈椎间盘纤维环细胞(Akt的免疫组化表达，×400)

图15 捏脊组颈椎间盘纤维环细胞(Akt的免疫组化表达，×400)

3.2 纤维环细胞ERK1/2、Akt的免疫组化检测结果

ERK1/2、AKT蛋白表达结果表明，空白组大鼠纤维环细胞均有较多的ERK1/2、Akt蛋白表达，且颜色较深，多呈强阳性(见图9、图13);模型组大鼠纤维环细胞颜色较浅，ERK1/2、Akt蛋白表达较少(见图10、图14)。捏脊组、莫比可组多呈弱阳性、阳性(见图 11、图12、图15、16)。图像分析结果(见表1)，与空白组比较，模型组ERK1/2、Akt阳性细胞数显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较，捏脊组ERK1/2、AKT阳性细胞数有显著提高(P＜0.05)，提示捏脊能够促进大鼠纤维环细胞ERK1/2、AKT的蛋白表达。

图16 莫比可组颈椎间盘纤维环细胞(Akt的免疫组化表达，×400)

4 讨论

4.1 颈椎病与捏脊疗法

颈椎病属于中医学“痹证”范畴，颈项部为主要发病部位。从经络角度来说，颈椎病发生与督脉、膀胱经关系密切。《灵枢·经脉》曰:“督脉之别，名曰长强，挟膂上项，散头上，下当肩胛左右，别走太阳，入贯膂。”督脉为“阳脉之海”，总督诸阳，头为诸阳之会，颈项背部属阳，足太阳膀胱经又与督脉旁通，五脏六腑的背俞穴均在膀胱经上，二经共主诸阳，故督脉与手足三阳经及颈项、脏腑经脉气血有密切联系。因此二经可运行气血精髓，上可传输于脑，下可濡养经脉所过之皮肉筋骨等部位;若二经经气虚无力升阳，气血精髓不能上达颈脑部，即导致颈项部肌肉筋骨脑髓失养，故此二经在维持颈项部正常功能有关键作用。现代研究表明，捏脊疗法既可疏调督脉、振奋阳气，又可刺激膀胱经背部腧穴，以协调脏腑功能，使机体达到气血通畅[11]，故捏脊疗法可作为通调二经治疗颈椎病的重要方法。

4.2 细胞外基质降解与基质金属蛋白酶关系

在椎间盘中细胞外基质占绝大部分，研究表明细胞外基质的降解可直接导致椎间盘力学特征丧失，进而加速椎间盘退变。Ⅰ、Ⅱ型胶原是椎间盘组织中主要的细胞外基质成分之一。MMP-1在Ⅱ型胶原降解中起关键的作用，而且其他许多MMPs对Ⅱ型胶原的降解均需通过它起作用。MMP-3不仅能分解聚集性蛋白多糖，也能裂解胶原，激活其他基质金属蛋白酶降解基质，是细胞外基质降解的关键酶[12]。本实验模型组椎间盘纤维环MMP-1、MMP-3的表达明显高于空白组，证实MMP-1、MMP-3均参与破坏椎间盘组织结构过程，从而导致椎间盘的退变。

4.3 纤维环细胞凋亡与Akt、ERK1/2

颈椎间盘退变的主要发病因素是软骨细胞的凋亡[13]。黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是整合素介导信号传导通路的中心分子，是多种信号通路的上游分子，通过ERK将细胞外信号最终传递至胞核，可调控细胞增殖、凋亡、黏附等生物学行为。研究表明，Integrin/FAK信号通路在椎间盘细胞凋亡中具有重要调节作用，激活Integrin/FAK信号通路可激活 ERK1/2，即激活通路 FAK-Ras-MAPK，MAPK信号通路对细胞的生长与凋亡具有重要调节作用，广泛存在于各种细胞中[14]。ERK1/2是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员之一，其被激活后，通过磷酸化可抗凋亡分子、激活转录因子而达到抗凋亡促进软骨细胞生长作用[4]。此外研究发现，ERK1/2信号传导通路的激活可诱导PI-3K被激活，进而通过Akt磷酸化一系列下游底物[5]，其中Akt是丝氨酸/酪氨酸家族成员之一，可促进软骨细胞Ⅱ型胶原的分泌，从而抑制软骨退变、减缓细胞凋亡。

本实验结果显示，捏脊疗法能降低纤维环细胞中MMP-1、MMP-3的表达及提高大鼠椎间盘纤维环细胞中Akt、ERK1/2的含量以控制椎间盘退变。而MMP-1、MMP-3的表达减少很可能与细胞外基质Ⅱ型胶原分解密切相关;同时Akt、ERK1/2含量的提高是否是通过信号通路 PI-3K-Akt、FAK-Ras-MAPK或其他相关通路的磷酸化来实现，还需进一步研究证实。

[1]Zigouris A，Alexiou GA，Batistatou A，et al.The role of matrix metalloproteinase 9 in intervertebral disc degeneration[J].J Clin Neurosci，2011，18(10):1424-1425.

[2]Roberts S，，Johnson WE.Analysis of aging and degeneration of the human intervertebral disc[J].Spine，1999，24(5):500-501.

[3]Kanemoto M，Hukuda S，Komiya Y，et al.Immunohistochemical study ofmatrixmetalloproteinase-3 and tissueinhibitorof metalloproteinase-i in human intervertebral discs[J].Spine，1996，21(1):1.

[4]周小莉，李荣亨.复元胶囊对软骨细胞凋亡细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路的作用研究[J].中国老年学杂志，2008，28(4):329-331.

[5]沈皆亮，胡侦明，钟小明，等.SIRTl通过AKT通路和ERKl/2通路共同调节退变髓核细胞细胞外基质的合成[J].中国老年学杂志，2013，33(8):1811-1814.

[6]金家华，张婉兰，周德宜.捏脊点穴手法治疗脊髓型颈椎病的疗效[J].中国骨伤，2010，23(2):137-138.

[7]王拥军，施杞，沈培芝，等.动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型的动态观察[J].中国中西医结合杂志，2001，21(3):199-202.

[8]柯玫瑰，廖军，徐腾.电针大椎穴对大鼠颈椎病模型纤维环细胞FAK蛋白表达的影响[J].福建中医药大学学报，2013，23(4):25-28.

[9]李忠仁.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社，2007:242-244.

[10]孙敬方.动物实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，2001:356-358.

[11]陈宏仁.捏脊疗法的作用机理和临床应用探讨[J].遵义医学院学报，2000，3(3):326.

[12]Kanemoto M，，Hukuda S，Komiya Y，et al.Immunohistochemical study of matrix metalloproteina-se-3 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in human intervertebral discs[J].Spine，1996，21(1):1-8.

[13]王栋琪，刘淼，宋焕瑾，等.人退变腰椎间盘中细胞凋亡与Bax及半胱胺酸蛋白酶蛋白3基因的表达[J].中国修复重建外科杂志，2008，22(4):421-425.

[14]Liu G， GuibaoCD，Zheng J.Structuralinsightinto the mechanisms of targeting and signaling if focal adnesion kinase[J].Mol cell Biol，2002，22:2751-2760.