转基因水稻基体标准物质候选物真实性的鉴定技术研究

余笑波， 应 荣， 俞晓平， 崔海峰， 王 晶，隋志伟， 李 亮， 臧 超， 叶子弘

（1.中国计量学院，浙江杭州 310018； 2.中国计量科学研究院，北京 100029）

转基因水稻基体标准物质候选物真实性的鉴定技术研究

余笑波1， 应 荣1， 俞晓平1， 崔海峰1， 王 晶2，隋志伟2， 李 亮2， 臧 超2， 叶子弘1

（1.中国计量学院，浙江杭州 310018； 2.中国计量科学研究院，北京 100029）

以PCR技术及琼脂糖凝胶电泳技术为基础，对转基因水稻克螟稻2号和阴性受体秀水11进行真实性鉴定。利用典型性检测、指纹图谱技术对候选物的转基因事件的真实性、转入事件正确性（是否为特异性目标外源基因）、品系遗传背景进行鉴定，结果表明，克螟稻2号只含特异性序列Cry1Ab，秀水11不含所选的外源基因，它们具有相同的遗传背景。随机各抽取克螟稻2号和秀水11水稻100株，通过特异性PCR、免疫印迹实验来检测原材料的纯度，结果表明，克螟稻2号为100%的转基因水稻，秀水11为100%的阴性受体水稻。

计量学；转基因水稻；基体标准物质；品系鉴定；纯度鉴定；指纹图谱技术

1 前 言

随着转基因作物及制品的推广，其安全性问题已逐渐引起人们的关注。越来越多的国家建立相关的技术体系和相关制度对转基因的安全性进行评估，设立了转基因标识的最低含量阈值。在此背景下，转基因水稻、玉米等［1，2］标准物质应运而生，并且越来越重要。

原材料的鉴定是转基因基体标准物质研制的基础。首先标准物质本身要求原材料具有溯源性，包括原材料的来源和品质是否符合真实性的要求。其次尽可能详细地了解原材料的背景有利于后期建立较好的标准物质制备体系。近年来，以微卫星标记为基础的水稻DNA指纹图谱构建逐渐展开［3，4］，越来越多的不同品种的水稻被重新整理和归类。对比转基因标准物质的原材料真实性鉴定的要求，种子资源品系鉴定技术只解决了转基因背景材料的品系真实性问题，并没有在转基因作物外源基因真实性和背景材料纯度上进行鉴定。

本研究针对转基因标准物质原材料真实性鉴定的要求提出鉴定技术方案，以克螟稻2号和阴性受体秀水11［5］为研究对象，从转基因事件的真实性、转入事件正确性（是否为特异性目标外源基因）、品系遗传背景及原材料的纯度等方面进行了鉴定研究。

2 材料与方法

2.1 水稻材料

转基因抗虫水稻克螟稻2号由浙江大学提供，转基因受体亲本秀水11由浙江省农业科学研究院提供，其余18个粳稻品种由中国水稻研究所和浙江省农业科学研究院提供。20个粳稻依次分别为：测21，湘虎25，秀水11，克螟稻2号，浙粳37，嘉禾218，春江03，台202，桂花黄，甬粳18，浙糯5号，秀水110，原粳35，秀水129，南粳41，秀水220，嘉花1号，浙粳22，秀水63，早单八。

2.2 方法

2.2.1 转化事件的真实性鉴定

为验证转基因克螟稻2号插入的外源基因只有Cry1Ab且未受其他转基因材料的污染，本文选取国内外具有代表性的抗虫水稻，包括我国繁育的转基因抗虫水稻KMD1（Cry1Ab）［6］、TT51-1（Bt融合型杀虫蛋白基因Cry1Ac／Cry1Ab）［7］和科丰6号（Cry1Ac＋CpTI）［8］，抗除草剂的水稻LLRICE62（Bar）和LLRICE601（Bar）［9］，选用根据边界序列设计的品系特异性引物，克螟稻2号（KMD2）为基因特异性引物（委托Takara公司，根据插入的外源基因Cry1Ab序列设计）。

以秀水11和克螟稻2号的基因组DNA为模板，进行PCR（Veriti96 well Thermal Cycler，Applied Biosystems）扩增，其PCR反应条件参考各自引用的文献来确定。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶下电泳（DYY-6D型，北京市六一仪器厂），结果在凝胶成像仪（212PRO，Carestream）中检测。表1为6种外源引物和内标准基因引物SPS［10］信息。

表1 SPS引物和6种外源引物

2.2.2 品系鉴定

为了建立秀水11及其转基因水稻克螟稻2号和其他18种粳稻的品系指纹图谱，选取GB／T 20396—2006［11］上推荐的48对随机简并引物和程保山等［12］所推荐的46对随机简并引物。供使材料的种子在25℃下浸泡24 h，保持水分，30℃培养7 d。取幼叶，用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，货号DP305-3）提取基因组并保存于－20℃冰箱待用。25μL的PCR反应体系，包括12.5mix（聚合酶、Mgcl2、4种核苷酸等），正反向引物各1μL，模板1μL，水9.5μL。反应程序采用经典的三步法进行。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳分离，为了使结果稳定可靠，相同随机引物进行2次重复扩增，其2次扩增产物的电泳图完全一致时作为结果。

2.2.3 纯度鉴定

本研究的纯度验证中，核酸水平上采用特异性PCR技术，蛋白水平上采用基于免疫印迹原理的试纸条法鉴定。确定秀水11的遗传背景和转基因水稻克螟稻2号的外源转入情况后，按照国标（GB／T 3543.5—1995）进行候选物的纯度验证。各取100株完整的秀水11和克螟稻2号叶片，在液氮中研磨，磨好的粉末分成两部分，一部分用天根试剂盒提基因组DNA，另一部分用于免疫印迹检测特异性外源蛋白。

在核酸水平上，分别对提取好的基因组DNA进行水稻内标基因SPS和KMD 2外源基因（序列见表1）PCR扩增，电泳检测产物，分析秀水11和克螟稻2号的纯度。

在蛋白水平上，根据说明书，分别取每个植株上的0.1 g叶片，磨碎，加入2 mL蒸馏水。将混匀的浮浊液移到2 mL的离心管中，静置，取上清。从包装中取出检测条，有“箭头”和“sample”标记端为样品端。样品端垂直向下，插入准备好的样品液中，样品端浸入样品液的深度约为0.5 cm，不超过“sample”标记部位。浸置10 s左右，取出平放，阅读检测结果。

纯度分析采用式（1）和式（2）

式中，P为品种纯度；t为供检种子数；t0异品种子数。

式中，p为标准值或标签值；q＝100－p；n为样品的粒数或株数。

3 结果与分析

3.1 转化事件的真实性鉴定

图1、图2分别为克螟稻2号和秀水11PCR产物的电泳图谱。图1表明，阳性水稻克螟稻2号存在特异性Bt抗虫性外源基因，没有被其它品种的抗虫性外源基因及抗除草性外源基因污染。图2表明，外源基因在阴性秀水11上没有扩增产物，没有被相关的外源基因污染，符合标准物质制备的要求。

3.2 候选物的指纹图谱分析

图1 克螟稻2号PCR产物的电泳图谱

图2 秀水11PCR产物的电泳图谱

根据引物的多态性从94对随机简并引物中筛选出14对简并引物，此多态性产物稳定性好、杂带少，且能够较好地区分克螟稻2号及其亲本秀水11与其他18种粳稻。以随机引物RM224在20个水稻中PCR产物的电泳图为例，结果见图3。图3表明SSR（引物RM224）具有3条多态性条带，其分子量大小约为160 bp、140 bp和130 bp，bp（base pair）为基因（碱基对）序列长。根据电泳图谱将20种水稻分为4类：1～4、6、7为一类；5为一类；8为一类；9～20为一类。

图3 秀水11及克螟稻2号和18种粳稻的SSR（RM224）带型比较

根据PCR扩增结果，视每条多态性条带为1个等位基因；在相同的迁移位置，将观察到的每片段作为一个性状，有带赋值“1”，无带赋值“0”，将有多态性的简并引物进行记录和制表。表2为由14对具有多态性引物构建的20种水稻指纹图谱，其品种编号1～20号与本文中第2.1节中20个水稻列出的次序对应。

根据表2，从横向看，秀水11和克螟稻2号（编号3和编号4）的指纹图谱信息一样，与其他18种粳稻相比，具有唯一的指纹信息，所以秀水11和其转基因水稻克螟稻2号具有相同的遗传背景，是同一品种。从纵向看，20种水稻在14对引物上呈现出不同的多态性和类别，表2表明，SSR（RM224）呈现出3种多态性和4个类别，分别为100，010，001及101；SSR336呈现出3种多态性和3个类别，分别为100，010及001。利用这14对引物的指纹图谱组合，能够较好地区分秀水11和克螟稻2号与18种粳稻。14对引物的特异性组合构成了秀水11和克螟稻2号的指纹图谱，由表2中的编号3和编号4得知为同一条信息链，即0100011010010010100011000100010101001。

表2 由14对具多态性引物构建的20种水稻的SSR指纹图谱

3.3 候选物纯度分析

对提取好的克螟稻2号和秀水11各100株基因组DNA进行1到100的编号，10个编号为1幅电泳图。秀水11只有内标准基因扩增（81 bp），为100%阴性，克螟稻2号既有内标准基因扩增（174 bp），又有目标外源基因扩增（81 bp），为100%阳性。

利用抗体抗原免疫显色反应原理，将100株克螟稻2号叶片和100株秀水11叶片进行试纸条检测，见图4和图5。

图4 秀水11试纸条法检测结果

图5 克螟稻2号的试纸条法检测结果

图4和图5表明，秀水11的100株均只有在对照线上有红线，检测线上无红线，克螟稻2号的100株不仅在对照线上有红线，检测线上也有红线，其结果与假定结果相符合。

根据纯度结果和容许差距公式可知，秀水11：T≤1.6；克螟稻2号：T≤1.6。因此，秀水11和其转基因水稻克螟稻2号的纯度符合作为种子原材料的纯度要求（≥99%）［12］。

4 讨 论

本文提出了转基因标准物质原材料真实性鉴定的技术体系。转基因作物转入事件的真实性鉴定需包含两方面的内容：一是转基因事件的真实性，包括转基因事件是否真实发生、外源基因是否为目标基因、插入位置是否正确。二是受体的真实性，即转基因作物的遗传背景是否为目标受体亲本。查阅相关文献，目前还未见针对秀水11品种进行品系鉴定的相关报道，将克螟稻2号和阴性受体秀水11与其他18种粳稻一起来构建指纹图谱，目的是为了鉴定和建立秀水11及其转基因水稻克螟稻2号的品系和图谱。纯度鉴定方面，在核酸水平鉴定的基础上，还进行蛋白水平的鉴定，可较好地解决转基因植物中基因失活或基因沉默现象的问题。实验结果表明，样品秀水11为100%阴性材料，克螟稻2号为100%阳性材料，符合候选物纯度需在99%以上的要求。

本文鉴定了转入事件的真实性，给出了秀水11的品系图谱，分析了秀水11及其阳性水稻克螟稻2号的纯度，为其它转基因作物标准物质原材料真实性鉴定提供了参考和借鉴。

［1］ 高运华，黎朋，刘张岚，等.转基因水稻标准物质的研制［J］.计量学报，2010，31（5A）：14－18.

［2］ 傅博强，臧超，宋贵文，等.转基因玉米MON810基体标准物质Q-PCR量值协同实验室研究［J］.计量学报，2011，32（6A）：114－118.

［3］ 施勇烽，应杰政，王磊，等.鉴定水稻品种的微卫星标记筛选［J］.中国水稻科学，2005，19（3）：195－201.

［4］ 张彦，郭士伟，何冰，等.利用SSR标记建立杂交水稻分子指纹图谱数据库［J］.江苏农业学报，2006，22（2）：181－183.

［5］ 余笑波，叶子弘，隋志伟，等.转基因水稻克螟稻标准物质的初制备［J］.计量学报，2011，32（6A）：101－105.

［6］ 谢家建，王锡锋，彭于发.转基因水稻品系克螟稻2号1的外源插入片段的旁侧序列：中国，101240278A［P］.2008-08-13.

［7］ 卢长明，吴刚，武玉花，等.转基因水稻TT51-1转化事件外源载体整合位点全序列及应用：中国，101302520A［P］.2008-11-12.

［8］ 谢家建，王锡锋，彭于发.转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列：中国，101240279A［P］. 2008-08-13.

［9］ RenéKöppel，Franziska Zimmerli，Alda Breitenmoser. Multiplex real-time PCR for the simultaneous detection and quanti Wcation of DNA from three transgenic rice species and construction and a pplication of an artiW cial oligonucleotide as referencemolecule［J］.EurFoodRes Technol，2010，230：731－736.

［10］ Jiang L，Yang L，Zhang H，etal.International collaborative study of the endogenous reference gene，sucrose phosphate synthase（SPS），used for qualitative and quantitative analysis of geneticallymodified rice［J］.JAgricFoodChem，2009，57（9）：3525－3532.

［11］ GB／T 20396—2006三系杂交水稻及亲本、真实性和品种纯度鉴定DNA分析方法［S］.

［12］ 程保山.SSR标记在粳稻恢复基因Rf-1转育、F1纯度和品种鉴定中的应用［D］.南京：南京农业大学，2007.

Research on Identification Technique for Raw Materials of Matrix Reference Materials of Transgenic Rice

YU Xiao-bo1， YING Rong1， YU Xiao-ping1， CUIHai-feng1， WANG Jing2，
SUIZhi-wei2， LILiang2， ZANG Chao2， YE Zi-hong1
（1.College of Life Sciences，China Jiliang University，Hangzhou，Zhejiang 310018，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100029，China）

Based on PCR and agarose gel electrophoresis，the authenticity of identification of transgenic rice KMD 2 and negative receptor Xiushui 11 is researched.The detection of special transgenic gene and other foreign genes in raw materials isby typicality identification.No other foreign genes are detected except special foreign gene Cry1Ab in transgenic rice KMD 2，and no foreign genes is detected in Xiushui 11.Based on fingerprint technology，including Xiushui 11 and KMD 2 there are 20 rice varieties，and the results showed that Xiushui11 and KMD 2 have the same fingerprint and also be different from other 18 rice varieties.Random sampling for KMD 2 and Xiushui 11，and take special PCR and immunoblotting technique for the selected samples purity，KMD 2 are 100%transgenic rice and Xiushui 11 are 100% negative receptors rice.

Metrology；Transgenic rice；Matrix reference materials；Line identification；Purity identification； Fingerprint technique

TB99

A

1000-1158（2014）05-0512-05

10．3969／j．issn．1000-1158．2014．05．21

2012-04-23；

2014-06-21

国家自然科学基金（31000357）；国家科技支撑计划项目（2012BAD27B01）；浙江省自然科学基金（Y3090173）；浙江省公益项目（2014C32022）；浙江省重点创新团队（2010R50028）

余笑波（1985－），男，浙江台州人，中国计量学院硕士，主要从事生物中核酸计量研究。yuxiaobo.123＠163.com