抑制miR-886-5p表达对SiHa细胞侵袭的影响

王建新 马翠花

宫颈癌为妇科常见恶性肿瘤之一，其发病率近年来呈上升趋势，严重威胁女性的生命健康，受到全世界的广泛关注［1］。虽然已知宫颈癌的发病与人乳头瘤病毒(HPV)感染有关，但是肿瘤的形成机制仍未完全阐明。近些年一类新的非蛋白编码microRNAs(miRNAs)的出现，为肿瘤研究提供了新的思路。miRNAs是一类长约21～24个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，在调节细胞增值，凋亡以及肿瘤的发生过程中起了很重要的作用［2，3］。有研究发现 miR-886-5p在宫颈癌的含量明显高于癌周及癌旁组织［4］。本实验通过下调人宫颈癌SiHa细胞miR-886-5p的表达，采用Transwell侵袭实验研究miR-886-5p在SiHa细胞中的生物学行为，为宫颈癌的诊治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 宫颈癌SiHa细胞购自协和医科大学基础医学研究所。带有GFP标签的抑制miR-886-5p表达及对照质粒(miR-886-5p inhibitors/NC)均来自中国吉玛公司。主要试剂:DMEM培养基购自GIBCO公司，三氯甲烷、异丙醇和无水乙醇均购自北京化学试剂公司，TRIzol试剂，MML-V试剂盒和 LipofectamineTM2000均为美国 Invitrogen公司产品，质粒小量提取试剂盒购自博大泰克公司，SYBR Premix Ex Taq试剂购自TakaRa公司，PCR扩增引物的合成与 DNA测序均由上海生工公司完成。Transwell®及培养皿均购自Corning公司，Matrigel购自BD公司。

1.2 细胞培养与转染 SiHa细胞培养于含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培养基内，每3天换液1次，0.25% 胰酶消化传代，倒置显微镜下观察。在转染前1天用12孔板接种细胞，每孔5×105个细胞，培养过夜，待转染带有GFP标签的miR-886-5p inhibitor/NC质粒，每组3个复孔。细胞长满60%培养孔底时，用不含血清的DMEM各500 μl分别稀释2 μg待转染质粒和5 μl LiPofectamine 2000 转染试剂，室温放置5 min后，将两者混合作用20 min形成DNA-脂质体复合物。分别将1 ml带有miR-886-5p inhibitor/NC质粒的DNA-脂质体复合物加入各培养孔，轻轻摇匀，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养过夜。

1.3 转染细胞的筛选 细胞转染24 h后，加入5 μg/ml Blasticidin进行筛选，每5天换液1次，直到长出细胞克隆，在显微镜下用胰酶消化，挑出克隆，移至10cm细胞培养皿继续用Blasticidin筛选液培养。3～4周后，荧光倒置显微镜下观察表达GFP的阳性克隆，再次用胰酶消化，挑出阳性克隆并用1 μg/ml Blasticidin筛选液大量培养。

1.4 实时定量PCR检测抑制水平 按产品说明书，用TRIzol提取细胞总RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳监测RNA质量。用M-MLV反转录酶将1 μg总RNA反转录为cDNA，保存于－80℃待用。使用ABI 7500 PCR仪，以hs-U6作为内参，进行实时定量PCR反应检测miRNA的表达，反应包括40个循环(95℃，30 s;60℃，1 min)，每次设立3个复孔。特异性miR-886-5p的上下游引物分别为5’-CGGGTCGGAGTTAGCTCA-3’和5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;U6 snRNA 的上下游引物分别为5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’和5’-GGAACGCTTCACGA-ATTTG-3’。其扩增曲线和融解曲线说明引物具有很好的特异性，将扩增产物进行DNA测序分析进一步证实扩增特异性。采用ΔΔCt法分析基因的表达水平［5］，即 RQ=2-ΔΔCt，［ΔΔCt=(CtmiRNA–CtU6)样品-(CtmiRNA–CtU6)校正样品］。每次实验包括以水为模板的阴性对照，根据(2-ΔΔCT)计算每对样本的相对表达量。

1.5 Matrigel体外细胞侵袭实验 对数生长期的各组细胞经PBS洗涤后，用0.25%胰酶消化制备成无血清DMEM单细胞悬液，调整细胞密度为5×104/ml。BD Matrigel TM Invasion Chamber结构包括上室和下室两个部分，上室已经铺好凝胶化的Matrigel基质，该物质模仿人体内的基底膜结构，胶的下方有一层PET膜，上面有许多直径8 μm的微孔，细胞根据其不同的侵袭能力突破基质胶后从小孔中穿过至PET膜的底面。上室加入100 μl无血清DMEM细胞悬液，下室加入650 μl含5%血清的DMEM培养基，将小室提起，去除气泡后，置37℃、5%CO2细胞孵箱温育12 h后，用棉签抹去上室上表面细胞和Matrigel凝胶后，用PBS洗涤5次，用10%的甲醇固定上室下表面细胞10 min，用10 μg/ml的DAPI染色1 min后于倒置显微镜下，每孔随机取3个视野计数后取平均值，重复实验3次进行统计学分析。

1.6 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，双尾t检验用于2组独立样本之间差异的比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后miR-886-5p的表达水平 应用实时荧光定量PCR检测转染后表达抑制组和对照组细胞中miR-886-5p的表达水平，表达抑制组明显低于对照组(P ＜0.05)。见图1。

图1 筛选稳定克隆后SiHa细胞中miR-886-5p的表达水平(U6snRNA为内参，*P ＜0.05，n=3)

2.2 miR-886-5p对宫颈癌SiHa细胞侵袭能力的影响 在显微镜下观察Matrigel体外侵袭实验结果，计数上室PET膜下表面穿出的细胞个数(焦距100×)，每组细胞每次随机计数10个视野取平均值为穿膜细胞均数。分别为Mock组穿膜细胞均数，稳转miR-886-5p inhibitor对照质粒穿膜细胞均数，稳转miR-886-5p inhibitor质粒穿膜细胞均数。差异有统计学意义(P＜0.05)。上述结果说明，稳定转染miR-886-5p inhibitor质粒的SiHa细胞其体外侵袭能力比未转染质粒及转染对照质粒组细胞均明显减弱。见图2。

图2 miR-886-5p对宫颈癌SiHa细胞侵袭能力的影响。A Matrigel侵袭实验分析SiHa细胞稳转miR-886-5p抑制质粒及其阴性对照质粒后的侵袭能力，侵袭膜下表面细胞DAPI染色后荧光倒置显微镜下观察结果(焦距100×);B镜下侵袭膜下表面细胞计数结果统计，数据用Mean±SD表示(*P ＜0.01，n=10)

3 讨论

miRNA作为生物体重要的基因调控分子，在多种恶性肿瘤组织中的表达与正常组织中存在显著差异，miRNA的紊乱表达可引起组织细胞的恶性转化，参与肿瘤的发生发展［6］。宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病与高危型人乳头瘤状病毒(HPV)的感染密切相关，但是感染后确切的分子机制仍不清楚。近来，与宫颈癌细胞的增殖、转移、凋亡密切相关的miRNA已逐渐引起人们的关注［7］。miRNA表达分析显示，miR-143、miR-145显著下调，能够抑制细胞生长，与肿瘤发生相关;miR-146a显著上调，具有促进细胞增殖的能力［8］。Iorio等［9］利用以 PCR 为基础的已建立的miRNA检测分析102例宫颈癌样本，发现miR-200a能够抑制宫颈癌细胞南上皮层向肌层侵袭，miR-200a过表达明显减少了宫颈癌细胞扩散转移。本研究结果表明，下调miR-886-5p可显著抑制SiHa细胞的侵袭能力。由此，我们初步推测miR-886-5p在宫颈癌中可能发挥癌基因的作用，提示靶向抑制miR-886-5p为宫颈癌的治疗提供了新思路。

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4 Li J-H，Xiao Xue，Zhang Y-N，et al.MicroRNA miR-886-5p inhibits apoptosis by down regulating Bax expression in human cervical carcinoma cells.Gynecologic Oncology，2011，120:145-151.

5 Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(Delta Delta C(T))method.Methods，2001，25:402-408.

6 Crocecm.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.Nat Rev Genet，2009，10:704-714.

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8 Wang X，Tang S，Le SY，et al.Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth.PLoS ONE，2008，3:e2557.

9 Iorio MV，Visone R，Di Leva G，et al.MicroRNA signatures in human ovarian cancer.Cancer Res，2007，67:8699-8707.