替比培南匹伏酯颗粒微生物限度检查方法的验证实验研究*

王 威，钱 斐，李倚云，闻琍毓

(扬州市药品检验所，扬州225009)

替比培南匹伏酯颗粒微生物限度检查方法的验证实验研究*

王 威1，钱 斐2，李倚云2，闻琍毓2

(扬州市药品检验所，扬州225009)

目的:建立替比培南匹伏酯颗粒微生物限度检查方法。方法:按《中国药典》2010年版附录微生物限度检查法中细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法进行验证。采用平皿法、离心沉淀法、薄膜过滤法及方法联合使用，以试验菌株菌数回收率不低于70%为要求，进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法选择，以试验组中检出大肠埃希菌为目标对控制菌进行方法试验。细菌计数、控制菌检查采用离心沉淀法联合薄膜过滤法;霉菌及酵母菌计数采用常规平皿法。结果:计数方法验证中试验组的五种菌株回收率均大于70%，控制菌检查试验组中检查出阳性对照菌。结论:建立的微生物限度检查方法可靠、准确，可作为替比培南匹伏酯颗粒微生物限度检查方法。

替比培南匹伏酯，微生物限度检查，验证实验，控制菌，薄膜过滤法

碳青霉烯类抗生素是20世纪70年代开发的β－内酰胺类抗生素［1］，其中替比培南匹伏酯是广谱抗菌药物，最早由美国辉瑞开发，日本在2009年上市，适用于治疗对青霉素敏感或耐药肺炎链球菌和流感嗜血杆菌所致感染，尤其是儿科患者耳、鼻、喉和上呼吸道感染［2］。

替比培南匹伏酯颗粒为口服制剂，对其受微生物污染的情况进行考查，根据《中国药典》2010年版的要求，需要对药品微生物限度检验方法进行相应的验证，建立检验方法。对具有抗菌活性的药品进行微生物限度检查，首先应去除抗菌活性。目前尚未见有关替比培南匹伏酯颗粒微生物限度检查方法完整研究的报道，为建立替比培南匹伏酯颗粒微生物限度检查方法，参考《中国药典》等［3］文献，以试验菌的回收测定为依据进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的有效性验证，并对控制菌检查方法进行了验证试验。建立科学、合理的检验标准，有利于对药品的染菌程度和安全性进行质量评价［4］，同时对促进该制剂质量控制水平的提高具有实际价值。

1 实验材料及仪器

1.1 仪器净化工作台(吴江市净化设备厂)，HTY 2000型智能集菌仪，多次使用集菌器，一次性薄膜过滤器(杭州泰林生物技术设备有限公司);高压蒸汽灭菌器，生化培养箱，霉菌培养箱(上海博讯实业有限公司)，电热恒温干燥箱(南京实验仪器厂)，离心机(上海手术器械厂)。

1.2 供试样品替比培南匹伏酯颗粒(规格50 mg，扬州市某药业有限公司，批号120501、120502、120503)。

1.3 试验用菌株大肠埃希菌(Escherichia coli)［［CMCC(B)44l02］、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］、白色念珠菌(Candida albican)［CMCC(F)98001］、黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98003］均来源于中国食品药品检定研究院。

1.4 培养基及冲洗液营养琼脂(120531)、营养肉汤(111214)、玫瑰红钠琼脂(110630)、改良马丁(111102)、胆盐乳糖(BL)(1104122)、4－甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基(110325)、pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液(1209272)，均由北京三药科技开发有限公司生产。

2 方法与结果

方法参照《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ微生物限度检查法计数方法的验证、控制菌检查方法的验证。

2.1 菌液制备取经30～35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌肉汤培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释为50～100 cfu/ml。取经23～28℃培养24～28 h的白色念珠菌的改良马丁培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释为50～100 cfu/ml。取经23～28℃培养5～7 d的黑曲霉改良马丁斜面培养物，加适量含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下孢子，并稀释为50～100 cfu/ml的孢子悬液。

2.2 供试液制备取每批次样品各10 g，分别加pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 ml，摇匀，作为1∶10的供试液①。分别取1∶10供试液①，500 r/min离心3 min(低速离心)，取全部上层液，为1∶10供试液②。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证试验及结果 为选择能有效去除替比培南匹伏酯抑菌活性的方法，采用了平皿法、低速离心沉淀法处理供试液与平皿稀释法联用及与薄膜过滤法联用，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的细菌代表菌、白色念珠菌、黑曲霉的真菌代表菌进行活菌计数回收试验，比较几种方法对各菌的回收结果，确定敏感菌株，并选择出回收率在70%以上的方法作为可去除抑菌活性的有效方法。

2.3.1 平皿法平皿中加入1∶10供试液①1 ml，分别各加入试验菌50～100 cfu，立即倾注琼脂培养基，每种试验菌平行制备2个皿，作为试验组。不加入供试液，同法测定相应加入的试验菌数，为菌液组;不加入试验菌，同法测定供试液1 ml中的本底菌数作为供试品对照组;计算回收率:试验组回收率(%)=［(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数］×100%。

2.3.2 低速离心沉淀联用平皿稀释法分别取1∶10供试液②1和0.2 ml加入平皿，以下操作按平皿法。

2.3.3 低速离心沉淀联用薄膜过滤法取1∶10供试液②1 ml分别加入装有约50 ml冲洗液的滤器中，过滤，用40～45℃保温的pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液300 ml分次冲洗，每次约50 ml，在最后1次冲洗液中加入1 ml含50～100 cfu试验菌的菌悬液，过滤，取膜菌面朝上贴于营养琼脂平板，平行制备2个膜;取1 ml菌悬液同法操作，作为稀释剂对照组;取供试液②1 ml同法操作，作为供试品对照组;取菌悬液加入平皿作为菌液组，计算试验组和稀释剂对照组的回收率。稀释剂对照组回收率(%)=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%。

2.3.4 结果平皿法3批样品的白色念珠菌回收率分别为90%、84%和87%;黑曲霉菌回收率分别为99%、80%和76%，见表1;大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌回收率均为0;采用低速离心沉淀联用平皿稀释方法供试液加入1 ml的回收率均为0，0.2 ml的回收率均低于70%，见表2。采用低速离心沉淀联用薄膜过滤法，试验组和稀释剂对照组大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌回收率均不低于70%，结果见表3。

由结果可知，供试品的细菌计数采用离心沉淀法结合薄膜过滤法，霉菌及酵母菌计数采用平皿法。

表1 霉菌及酵母菌计数方法验证试验结果

表2 细菌计数方法验证菌回收率(0.2 ml)结果

2.4 控制菌检查验证试验方法及结果取1∶10供试液①10 ml共5份，其中2份分别加入BL增菌培养基100 ml(常规法)和200 ml(稀释法)中，1份用500 r/min离心3 min，取出全部上清液加入BL增菌培养基100 ml(离心沉淀法)，均加入大肠埃希菌10～100 cfu;另2份分别用500 r/min离心3 min，取出全部上清液按薄膜过滤法冲洗300 ml(离心联合薄膜过滤法)，取膜加入BL增菌培养基100和200 ml，在最后1次冲洗液中加入大肠埃希菌10～100 cfu，均作为试验组。同时取含10～100 cfu大肠埃希菌菌悬液，不加供试液，分别按上述对应方法操作，加入BL增菌培养基中，作为对照组。另取pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液10 ml加入100 ml BL增菌培养基中，作为阴性对照组。按《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查法中大肠埃希菌检查条件进行试验。结果各方法的对照组均检出大肠埃希菌，阴性对照组无菌生长，试验组中常规法、稀释法、离心沉淀法均未检出大肠埃希菌，采用离心联合薄膜过滤法，100和200 ml增菌培养基中均检出大肠埃希菌。由结果可知，控制菌大肠埃希菌检查采用离心沉淀法联合薄膜过滤法，可有效去除供试品的抑菌性。

表3 细菌计数方法验证试验结果

3 讨论

3.1 替比培南匹伏酯为β－内酰胺类广谱抗菌药，该试验以《中国药典》规定的验证用菌株分别进行活菌回收率测定。试验结果显示，细菌代表菌株回收率平皿法为0，离心沉淀联合平皿法加样量1 ml为0，0.2 ml均低于20%，说明药物对细菌有强抗菌活性，采用离心沉淀联合薄膜过滤法1∶10供试液1 ml回收率均高于70%;采用平皿法白色念珠菌、黑曲霉的菌回收率均不低于75%，未显示对真菌有抑菌活性;在控制菌大肠埃希菌检查验证试验中采用了离心沉淀法联合薄膜过滤法才检出阳性菌。故该制剂微生物限度检查细菌计数和控制菌检查采用离心沉淀法联合薄膜过滤法、霉菌及酵母菌计数采用常规平皿法。

3.2 对于抗生素药物的微生物限度检查，多采用薄膜过滤法，去除抑菌物质，但要求药物本身的溶解性要好［5］。在方法学验证试验探索时，采用1∶10供试液①往往出现不溶颗粒物吸附于滤膜表面，即便通过增加冲洗量也无法有效去除抑菌物质。而采用离心沉淀联合薄膜过滤法，可以先有效去除不溶颗粒物，消除上述不利影响。另外颗粒剂中糖分溶解后，供试液黏度增加，当增加冲洗液温度至40～45℃，可以提高冲洗效果、排除抑菌活性物质，分析原因是由于替比培南匹伏酯难溶于水，冲洗液温度较低时，药物及辅料溶解不充分，造成药物不能冲洗干净。

3.3 在计数方法验证试验中已反应出本品对大肠埃希菌的抑菌作用，在控制菌大肠埃希菌检查中亦体现了这一点。采用离心沉淀与薄膜过滤法可有效消除抑菌作用，达到试验目的。以上建立的方法可有效地控制药品质量，可作为替比培南匹伏酯颗粒的微生物限度检查方法。

1董耘婷，张永信.碳青霉烯类抗生素的发展与展望［J］.上海医药，2011，32:316

2胡云建，陈东科，陶凤荣，等.替比培南匹伏酯的体外抗菌作用研究［J］.中国临床药理学杂志，2012，28(12):950

3中国药典［S］.二部.2010:附录107

4苏德模，马绪荣.药品微生物学检验技术［M］.北京:华龄出版社，2007:221－227

5孙伟，刘文杰，崔颖，等.β－环糊精在喹诺酮类抗生素药品微生物限度检查方法建立中的应用［J］.药物分析杂志，2013，33(1):18

Study on microbial limit test method of tebipenem pivoxil granule

Wang Wei1，Qian Fei2，Li Yiyun2，Wen Liyu2
(Yangzhou Institute For Drug Control，Yangzhou 225009)

Objective:To establish a method for the microbial limit test of Tebipenem Pivoxil granule.Methods:The validation on the microbial limit test method was conducted by counting method of bacteria，mycetes and yeasts and also the control bacteria test method，which were all stated in the Appendix of China Pharmacopoeia(2010 edition).By combined use of culture dish method，centrifugal sedimentation method and membrane filtration method，we selected the counting method of bacteria，mold and yeast with a request that the test strains bacteria recovery rate was not lower than 70%.Then，we conducted a method test on the control bateria with the goal to test the escherichia coli in the experimental group.The bacteria counting and control bacteria check were performed by joint use of sedimentation method and membrane filtration method;Molds and yeasts count were conducted by culture dish method.Results:The recoveries of five strains in the test group were more than 70%in the validation of organisms counting method.The positive control bacteria was found in the experimental group of control bacteria check.Conclusions:The established method is accurate and reliable，which can be used for the microbial limit test of Tebipenem Pivoxil granule.

tebipenem pivoxil，microbial limit test，control bacteria，membrane filtration method

R927.11

A

1006-5687(2014)01-0007-04

2013-10-20