HPLC-ELSD法测定复方阿胶黄芪膏中黄芪甲苷含量的可靠性

李矗，刘圣，王珍

（1.安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥 230001；2.安徽省食品药品审评认证中心）

HPLC-ELSD法测定复方阿胶黄芪膏中黄芪甲苷含量的可靠性

李矗1，刘圣1，王珍2

（1.安徽医科大学附属安徽省立医院、安徽省立医院，合肥 230001；2.安徽省食品药品审评认证中心）

目的建立复方阿胶黄芪膏中黄芪甲苷的含量测定方法。方法采用HPLC-ELSD法，Alltima C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），乙腈-水（35∶65）为流动相，ELSD漂移管温度103℃，载气（N2）压力：0.2 MPa。结果黄芪甲苷在88.1～440.5μg／mL范围内呈良好的线性关系，r＝0.9998（n＝5）。平均回收率97.05%，RSD＝1.22%。结论HPLC-ELSD法准确可靠，可用于复方阿胶黄芪膏的质量控制。

黄芪；色谱法，高压液相；质量控制

复方阿胶黄芪膏由阿胶、黄芪、山楂、枸杞子、黑芝麻、龙眼肉、明胶等制成，具有健脾消积，行气和胃之功［1］。黄芪为方中臣药，而黄芪甲苷为黄芪的主要活性成分之一，故选择黄芪甲苷作为控制该产品质量的定量指标，黄芪甲苷含量测定常用薄层扫描法，但该法准确度差，重复性不强，操作繁琐［2-4］，而HPLC-ELSD法可快速、有效准确地测定黄芪甲苷的含量。

1 仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪（美国），包括：四元泵，在线脱气机，柱温箱，化学工作站（chimstation system工作站），Alltech2000ELSD检测器（美国）；梅特勒托利多xp56型百万分之一电子天平（瑞士）；赛多利斯BSA224S电子分析天平（德国）。复方阿胶黄芪膏（批号：130110、130112、130114）和阴性制剂均由安徽省立医院提供；黄芪甲苷（中国药品生物制品检定所，批号：110781-200512）；乙腈和甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）柱；流动相：乙腈-水（35：65）；柱温：30℃；流速：1.0 mL／min；ELSD漂移管温度：103℃，载气（N2）压力：0.2MPa。

2.2 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1毫升含0.4405 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取复方阿胶黄芪膏适量，研匀，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，用水补足减失的重量，摇匀，离心（4000 r／min，5 min），精密量取上清液25 mL置分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取5次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，用2%氢氧化钠试液洗涤两次，每次25 mL，弃去洗涤液，再用正丁醇饱和的水洗涤两次，每次25 mL，弃去水溶液，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定量转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm的滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备 取缺黄芪的缺味阴性制剂，按“供试品溶液的制备”项下的方法处理，即得。

2.5 专属性实验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μL，注入液相色谱仪测定，结果在与对照品色谱相应位置上，供试品溶液与其他组分分离度良好，阴性对照无干扰，见图1。理论板数以黄芪甲苷峰计算为6533，黄芪甲苷峰与相邻峰分离度为3.88（R＞1.5），拖尾因子为0.99（0.95≤T≤1.05），符合药典规定。

2.6 线性关系考察 分别精密吸取浓度为0.4405 mg／mL的对照品溶液2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取上述对照品溶液各20μL，依次注液相色谱仪中，测定峰面积。以对照品浓度的常用对数值为横坐标，峰面积常用对数值为纵坐标，计算得回归方程为：Y＝1.4364X-0.3365（r＝0.9998，n＝5）。结果表明：黄芪甲苷浓度在88.1～440.5μg／mL之间浓度对数值与峰面积对数值呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定。重复进样5次，测定峰面积值，分别为：1324.9、1375.2、1373.3、1359.0、1380.5、1385.6，RSD为1.63%，结果表明：表明本法精密度良好。

2.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别间隔0、2、4、6、8、10 h后依法测定，测定峰面积值，分别为：1305.9、1377.8、1387.8、1377.4、1343.4、1322.3，RSD为2.49%，结果表明：表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.9 重现性实验 取同一批号（130110）的样品6份，分别按上述方法制备、测定黄芪甲苷含量，结果含量分别为：0.4532 mg／粒、0.4499 mg／粒、0.4429 mg／粒、0.4299 mg／粒、0.4339 mg／粒、0.4430 mg／粒，平均含量为0.4421 mg／粒，RSD为2.03%，结果表明：表明本法重现性良好。

2.10 回收率试验 精密称取已知含量的样品（0.4421 mg／粒）9份，分别精密加入一定量的黄芪甲苷对照品，按供试品溶液制备方法制备并测定，结果表明：本法具有良好的回收率，见表1。

2.11 样品测定 按上述色谱条件，依法对3批样品中黄芪甲苷的含量进行了测定，结果：批号130110含量为0.4421 mg／粒、批号130112含量为0.4609 mg／粒、批号130114含量为0.4655 mg／粒。

表1 回收率测定结果

3 讨论

制备供试品溶液时，曾对洗涤萃取后的正丁醇溶液选择了2%NaOH溶液和氨试液，结果发现以2%NaOH溶液洗涤正丁醇所得供试品溶液中黄芪甲苷的含量较高。还对萃取后是否通过D101型大孔吸附树脂柱进行了比较，结果发现通过D101型大孔吸附树脂柱对结果无明显影响，不通过D101型大孔吸附树脂柱的供试品溶液，在黄芪甲苷峰附近也无干扰峰，故最终确定此供试品溶液的制备方法。

关于流动相的选择，考察的2010年版药典中黄芪甲苷项下的流动相乙腈—水（32∶68）和相关报道中的流动相乙腈—水（30∶70）及乙腈—水（35∶65），结果均能使黄芪甲苷达到药典规定的分离度和理论塔板数，但乙腈—水（32∶68）和乙腈—水（30∶70）相对分离时间较长，故选择乙腈—水（35∶65）为流动相进行分析［5-8］。

黄芪甲苷的含量测定方法报道多为薄层扫描法，但该方法结果准确性受显色效果的影响较大。而本研究结果显示以蒸发光散射检测器测定黄芪甲苷的含量，黄芪甲苷浓度在88.1～440.5μg／mL之间浓度对数值与峰面积对数值呈良好的线性关系，而且以蒸发光散射检测器测定精密度良好、稳定性高、重复性好。

［1］ 国家药典委员会.中国药典（2010年版一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：175.

［2］ 周晶.薄层扫描法测定六味补气胶囊中黄芪甲苷的含量［J］.安徽医药，2013，17（1）：37-38.

［3］ 张昌文，彭宣文.薄层扫描法测定升胃颗粒剂中黄芪甲苷的含量［J］.亚太传统医药，2012，8（9）：20.

［4］ 刘乔明，刘跃林.健心胶囊的制备及质量控制［J］.中国药业，2012，21（11）：31.

［5］ 国家药典委员会.中国药典（2010年版一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：283.

［6］ 白娟，张洁，李成网.HPLC-ELSD测定玉屏风软胶囊中黄芪甲苷的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（16）：102.

［7］ 江延辉.HPLC-ELSD法测定复方芪参片中黄芪甲苷的含量［J］.中医现代中药，2013，15（4）：314.

［8］ 郭强.HPLC-ELSD法测定老年咳喘片中黄芪甲苷的含量［J］.中医研究，2013，26（6）：76.

Determ ination of astragaloside IV in Compound Ejiao Huangqi Extract by HPLC-ELSD method

LIChu*，LIU Sheng，WANG Zhen（*The Affiliated Anhui Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230001，China）

ObjectiveTo establish amethod for the determination of astragaloside IV in Compound Ejiao Huangqi Extract.Method HPLC-ELSDmethod was used in the quantitative analysis by using a Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）column.The mobile phase was acetonitrile-water（35：65），ELSD evaporator tube temperature was 103℃，and pressure of carrier-gas（N2）was0.2MPa.ResultsThe calibration curve had good linear relationship within the range of 88.1-440.5μg／m L for astragaloside IV（r＝0.9998，n＝5）.The average recovery was 97.05% and RSD＝1.22%.ConclusionThe HPLC-ELSDmethod is accurate and reliable，which can be used for the quality control of compound Ejiao Huangqi Extract.

Astragalusmembranaceus；Chromatography，high pressure liquid；Quality control

R282.71

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.06.006

2014-06-26）

李矗，副主任药师，Email：leetrue2000＠126.com