高脂饮食C57BL／6J小鼠Ym-1蛋白表达与胰岛素抵抗的关系

李春燕，李素梅，王维，方星星，赵娜

（1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院内分泌科，合肥 230001；2.安徽医科大学病原生物学教研室）

高脂饮食C57BL／6J小鼠Ym-1蛋白表达与胰岛素抵抗的关系

李春燕1，李素梅1，王维2，方星星1，赵娜1

（1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院内分泌科，合肥 230001；2.安徽医科大学病原生物学教研室）

目的探讨巨噬细胞选择性活化与肥胖相关性胰岛素抵抗间的关系。方法28只3周龄雄性C57BL／6J小鼠，随机平均分为2组：普食组（A组，n＝14只），高脂饮食组（B组，n＝14只），分别给予标准饲料与高脂饲料喂养。6周、12周分别检测空腹血糖（（FBG）、血浆胰岛素（FIns）水平，并计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），测定肝组织匀浆三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）及丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平；HE染色观察肝脏及脂肪组织病理学改变，DAB染色及免疫荧光染色检测小鼠肝脏、脂肪组织M2型巨噬细胞的特异性蛋白Ym-1表达情况。结果第6周B组小鼠体质量、FIns、HOMA-IR、TC均明显高于A组，FBG、TG、ALT较A组升高不明显；第12周B组小鼠体质量、FBG、FIns、HOMA-IR、TC、TG和ALT进一步升高，均明显高于A组。第12周B组小鼠脂肪组织内巨噬细胞选择性活化标志Ym-1蛋白表达较A组增强。结论巨噬细胞选择性活化可能参与了肥胖诱导胰岛素抵抗的发生。

胰岛素抗体；巨噬细胞活化；膳食，高脂；模型，动物

巨噬细胞在炎症和组织修复过程中具有重要作用，脂肪组织慢性炎性与肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病关系十分密切，大量巨噬细胞的浸润是脂肪组织慢性炎症重要特征［1］。巨噬细胞可被多种刺激因子激活，主要分为M1型和M2型两大类［2-3］。

研究表明，肥胖相关的胰岛素抵抗与巨噬细胞的活化有着密切关系［4］。鉴于目前巨噬细胞亚型与胰岛素敏感性的研究报道较少，本文通过M2型巨噬细胞特异性Ym-1蛋白的表达拟探讨食源性肥胖小鼠体内M2型巨噬细胞与胰岛素抵抗间的关系的研究。

1 材料和方法

1.1 小鼠模型制备及取材

1.1.1 模型制备 3周龄雄性C57BL／6J小鼠28只，安徽医科大学实验动物中心提供，平均体质量（13.6±2.6）g。普食适应性喂养1周后，随机分为2组，每组14只。其中A组：普食组，B组：高脂饮食组。称体质量、剪尾测血糖记录作为基础指标。SPF清洁级饲养，每3天换饲料和饮用水1次，每周称体质量记录之。高脂饲料由67.7%基础饲料，20%蔗糖，10%熟猪油，2%胆固醇，0.3%三号胆盐加工成。

1.1.2 标本收集 造模6周和12周末，各组随机选取C57BL／6J小鼠7只，隔夜禁食，称量体质量，剪尾血糖仪测空腹血糖（FBG），分别予以10%的水合氯0.0035 mL／kg腹腔注射麻醉小鼠，眼球摘除收集血清、固定小鼠、打开腹腔取腹部脂肪、肝组织，部分组织置4%多聚甲醛溶液固定，其余组织放冻存管中液氮保存、待用。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 仪器 KY-190型全自动生化分析仪（南京特康生化分析仪器有限公司），紫外分光光度仪（美国哈希公司），DFM-96型10管放射免疫γ计数仪（安徽合肥众成机电公司）。

1.2.2 试剂 兔抗小鼠Ym-1一抗（加拿大STEMCELL公司），TC、TG测定试剂盒（长春汇力公司），ALT测定试剂盒（南京建成公司），胰岛素放免测定试剂盒（北京北方研究所），SP法免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥公司），山羊抗兔IgG FITC标记二抗（北京中杉金桥公司）。

1.3 实验方法及实验指标测定

1.3.1 血清胰岛素水平测定 血清胰岛素水平测定采用放射免疫法测定，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 TC、TG及ALT测定 紫外分光光度计测定TC、TG，全自动生化分析仪测定ALT。

1.3.3 肝脏、脂肪组织巨噬细胞Ym-1的表达 小鼠新鲜肝脏及脂肪组织置4%多聚甲醛溶液中固定48h，石蜡包埋，切片机连续切片（片厚4μm）。DAB染色步骤及免疫荧光染色步骤均按试剂盒说明书操作，每张切片平均彩图5幅，图像分析处理采用image-pro plus 6.0软件分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件进行统计学分析，两组间数据的显著性比较采用两独立样本t检验，相关指标采用pearson相关系数分析。

2 结果

2.1 高脂饮食对小鼠体质量的影响 见表1。

表1 各组C57BL／6J小鼠体质量变化（±s，g）

表1 各组C57BL／6J小鼠体质量变化（±s，g）

注：与普食组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

组别鼠数（只）0周6周12周普食组14 12.38±1.27 24.27±0.82 28.33±1.78高脂饮食组14 12.82±0.85 26.38±1.24a32.5±1.09b

2.2 高脂饮食对小鼠FBG、FIns、HOMA-IR水平的影响 见表2。

2.3 高脂饮食对小鼠TC、TG、ALT水平的影响见表3。

表2 各组C57BL／6J小鼠血清指标比较（±s，n＝7）

表2 各组C57BL／6J小鼠血清指标比较（±s，n＝7）

注：与普食组比较，aP＜0.01，bP＜0.05

组别FBG（mmol／L）FIns（IU／L）6周12周6周12周HOMA-IR 6周12周普食组8.97±2.90 8.30±1.50 9.0±2.49 10.31±2.62 0.43±0.21 0.34±0.13高脂饮食组8.47±0.25 10.12±1.04a30.98±16.5a46.16±10.18a6.79±2.38b17.5±6.16a

表3 C57BL／6J小鼠肝匀浆生化指标比较（±s，n＝7）

表3 C57BL／6J小鼠肝匀浆生化指标比较（±s，n＝7）

注：与普食组比较，aP＜0.01

组别TC（mmol／L）TG（mmol／L）ALT（mmol／L）6周12周6周12周6周12周普食组2.39±0.13 2.64±0.64 1.36±0.66 1.47±0.18 23.12±4.21 24.56±7.82高脂饮食组3.92±0.20a4.41±0.59a1.42±0.54 1.92±0.17a30.56±6.67 60.27±10.06a

表4 两组小鼠12周脂肪组织M2型巨噬细胞Ym-1蛋白表达情况（±s）

表4 两组小鼠12周脂肪组织M2型巨噬细胞Ym-1蛋白表达情况（±s）

注：与普食组比较，aP＜0.01

组别鼠数（只）巨噬细胞／脂肪细胞DAB染色IOD免疫荧光IOD普食组7 0.434±0.071 10 359.15±1 655.91 4 864.13±179.15高脂饮食组7 0.791±0.053a16 345.15±2 399.58a12 776.4±3 550.89a

2.4 肝组织及脂肪组织Ym-1蛋白表达 分组喂养6周、12周，A组、B组肝组织DAB染色及免疫荧光染色均未见M2型巨噬细胞特异性Ym-1蛋白的表达。高脂喂养第6周，B组小鼠腹部大网膜未见明显脂肪组织，高脂喂养第12周可见腹部大网膜脂肪组织，DAB染色及免疫荧光染色结果均表明A组脂肪组织可见少量M2型巨噬细胞特异性Ym-1蛋白表达，各组单个视野下（×400，每组计5个视野进行统计分析）M2型巨噬细胞表达情况，见图1，表4。

2.5 脂肪组织Ym-1蛋白的表达分别与FBG、FIns、HOMA-IR相关分析 见表5。

表5 Ym-1蛋白分别与FBG、FIns、HOMA-IR的相关分析

3 讨论

动物模型研究显示在正常脂肪组织中巨噬细胞以M2型为主，高表达IL-10，肥胖过程中，聚集于坏死脂肪组织周围的巨噬细胞以M1型为主，高表达TNF-α、IL-6、iNOS等M1标志，上述因子可造成胰岛素抵抗，同时肥胖过程中定植于脂肪组织的巨噬细胞多表达M2型有关的基因产物［5-9］，并进一步证明IL-10可增加脂肪细胞的糖摄取并抑制细胞因子肿瘤坏死因子α介导的胰岛素抵抗［10-11］。在正常饮食大鼠中敲除巨噬细胞PPAR-γ基因，导致M2巨噬细胞数量减少，功能受损，胰岛素敏感性降低［12］，以上研究证实M2巨噬细胞可改善饮食相关性胰岛素抵抗。

作为M2型巨噬细胞特征性的标志物之一的Ym-1蛋白是一种新的嗜酸粒细胞趋化因子，它可破坏多种寄生虫（包括幼虫）结构成分壳多糖等，从而抵抗虫体入侵［13］，巨噬细胞中的Ym-1基因可升高IL-10水平促进M2巨噬细胞的抗炎作用［14］。本文肝脏组织DAB染色及疫荧光结果均未见明显的M2型巨噬细胞浸润，表明肝脏组织中浸润可能有其他类型的炎性细胞，但肥胖组脂肪组织中M2型巨噬细胞特异性Ym-1蛋白表达较正常组增强，表明肥胖过程中脂肪组织中M2型巨噬细胞表达增强，与Fujisaka［2］的研究结果一致。另外Prieur等［4］研究表明肥胖初期脂肪组织中以M2型巨噬细胞为主，随着肥胖的发生发展脂肪组织中巨噬细胞逐渐向M1极化同时伴随着重度肥胖及胰岛素抵抗。

本研究中C57BL／6J小鼠大网膜脂肪组织Ym-1蛋白表达与FBG、FIns、HOMA-IR呈正相关分析，可能与肥胖过程中，M1型巨噬细胞与M2型巨噬细胞比例失调，M1型巨噬细胞降低胰岛素敏感性的效应远大于M2型巨噬细胞改善胰岛素抵抗的效应有关，与Fujisaka等［2］研究一致。

鉴于M2型巨噬细胞在脂肪组织中表达，且肥胖、脂肪炎症和胰岛素抵抗三者之间关系密切，推测M2型巨噬细胞可能是抑制肥胖小鼠及胰岛素抵抗的重要因素。特异性影响巨噬细胞的极化，或可为干预肥胖相关的胰岛素抵抗及2型糖尿病奠定理论基础，但目前M2型巨噬细胞与肥胖相关的胰岛素抵抗研究尚处于探索阶段，许多问题尚待阐明。

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The correlation of the expression of Ym-1 in adipose tissue in high-fat diet-fed C57BL／6Jm ice and insulin

resistance

LIChunyan*，LISumei，WANGWei，FANG Xingxing，ZHAO Na（*Department of Endocrinology，Anhui

Provincial Hospital，Hefei230001，China）

LISumei，Email：lisumei＠medmail.com.cn

ObjectiveTo explore the relationship between the selective activation ofmacrophages and insulin resistance.Methods 28 male C57BL／6Jmice were randomly assigned into 2 groups.the standard chow group （group A，n＝14），micewere fed with basic diet，and high-fat diet-fed group（group B，n＝14），mice were t fed with high-fat diet.At6 and 12 weeks，the levels of fasting peripheral blood glucose（FBG），fasting plasma insulin（FIns）were detected and the levels of triglyceride（TG），cholesterol（TC）and glutamic pyruvic transaminase（ALT）were alsomeasured.The changes in adipose tissue and liver were observed.The expression of Ym-1proteinin was detected.ResultsCompared with group A，the bodymass，the level of FIns，HOMA-IR，and TC in group B were significantly increased at the 6th week.However，there were no statistically differences in the levels of FBG，TG and ALT.The body mass，the levels of FBG，FIns，HOMA-IR，TC，TG and ALT in group B were significantly higher than those in the group A at the 12th week.The expression ofmacrophages specificmarker Ym-1 in adipose tissuewas significantly increased in group B at the 12th week compared with that in group A.ConclusionSelective activation ofmacrophage may play a role in the development of obesity-related insulin resistance.

Insulin antibodies；Macrophage activation；Diet，high-fat；Models，Animal

R392

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.04.017

2014-01-05）

安徽省卫生厅资助项目（13zc017）

李春燕，医师，Email：ahtclcy＠163.com

李素梅，主任医师，Email：lisumei＠medmail.com.cn