武定鸡抗马立克氏病相关基因的研究进展

周 勇 张 健 杨斯涵 王皓然 杨亮宇 何云波

（1.云南农业大学，云南昆明 650201 2.昆明市宜良县匡远畜牧兽医站，云南昆明 650201）

武定鸡是全国著名的地方鸡种，属肉用型，以体型大、肉质鲜、外观美等特点闻名，主要分布于云南省的武定、禄劝等地。当地民众在其饲养过程中恪守“只向外卖鸡，不向外买鸡”的乡规民约，使鸡群长期处于自繁自养的封闭状态。由于繁殖过程中自然环境的封闭和人为因素的干预，使其基因更具原始性和保守性，从而更能保留独特的基因型。

马立克氏病（MD）是由疱疹病毒科B亚群马立克氏病病毒（MDV）引起的鸡的一种淋巴组织增生性肿瘤病，与鸡新城疫、传染性法氏囊病并称为危害养鸡业发展的三大主要疫病。目前，MD主要防控措施是对鸡进行MDV不同血清型疫苗的接种，但近年来MDV毒力不断增强，已发现其超强毒株可以突破CVI988疫苗的保护，正如Kreager提出的每种MDV疫苗使用期只有10年。为弥补疫苗免疫的不足，许多学者对鸡MD抗性基因进行了研究，发现主要组织相容性复合体（MHC）、生长素（GH）基因和数量性状位点（QTL）等为其抗性基因。而我们在对武定鸡易发病调查过程中发现时有MD出现且不同鸡群发病情况差异明显。基于此，本文就目前研究发现的MD抗性基因进行综述，总结前人有效的检测方法，为武定鸡MD抗性相关基因的研究提供参考。

1 主要组织相容性复合体（MHC）

鸡MHC亦称B复合体[1]，分为B复合体和Rfp-y基因，位于第16号染色体，编码能引起机体异体排斥反应抗原系统的一组高度多态性的基因群。鸡B复合体主要由B-F、B-L和B-G三个功能性基因组成，B-F和B-L所编码的抗原在结构和功能上分别类似于哺乳动物MHCⅠ类和Ⅱ类抗原，B-G抗原为禽类所特有。Bacon[2]在对鸡群中不同MHC-B单倍型对MD抗性差异性研究过程中，发现对MD抗性最强的是B21单倍型，中等为B2和B6单倍型，易感为B9、B13和B15单倍型。

1.1 B-F基因

B-F基因编码MHCⅠ类抗原，由α链基因组成。α链基因有八个外显子包括：一个编码信号序列外显子；二个编码胞外区外显子；一个编码转膜区外显子；二个参与编码胞质尾区外显子以及3'-UTR区和5'-UTR区的编码外显子组成。鸡B-F基因与细胞免疫关系密切，对MD、禽白血病、鸡瘟等多种疾病有抗性[3]。

Briles等[4]以Cornell品种抗MD的N系和易感P系鸡群作为研究对象，其中P系由B19和B13的单倍型组成，N系仅含B21单倍型。通过两个品系的杂交F1代中B19/B21的母鸡与B19/Bl9的公鸡回交后，经MDV攻毒后，发现其子代B19/B19的MD发病率约是B19/B21的三倍；将F1代中B19/B21的公鸡与B19/Bl9的母鸡回交后，经MDV攻毒后，其子代B19/B19的MD发病率约是B19/B21的六倍。结果表明B21单倍型对MD的抗性远高于B19单倍型。随后，Briles等[5]又利用MDV强毒株对重组单倍型B19/B19、B19/B21和B19/BF21-G19的小鸡攻毒，发现B19/B21和B19/BF21-G19的MD发生率远低于B19/B19单倍型，表明B-F亚区是MD抗性基因。

后来，Rogers等[6]对位于B-F/L区域的NK细胞受体样蛋白基因研究，认为其可作为MDV抗性的候选基因；Jin等[7]在对抗MD纯合子霞烟鸡B-F基因多态性分析时，利用RFLP技术分析了霞烟鸡的B6、B19和B21单倍型，发现B21单倍型对MDV抗性最高，B6单倍型对MDV抗性相对较弱，B19单倍型对MDV抗性最弱，结果表明不同B单倍型对MDV抗性差异明显；随后Jin等[8]对不同单倍型的B-F1/B-F2基因序列测定比较中，发现序列中多态性主要表现在B-F基因的α1α2区域；左天荣[9]在对抗MD霞烟鸡与非抗MD霞烟鸡B-F基因序列的研究中，利用B-F基因的α1α2区域设计引物，并确定目的片段为567 bp，PCR反应产物测序后与Genbank公布的 B2、B6、B5、B13、B19、B21和B21-LIKE单倍型基因序列进行比较分析，发现该区域内碱基替换频繁并呈高度多态性，并证明抗MD霞烟鸡与非抗鸡在此区域存在基因差异。

1.2 B-L基因

B-L基因编码MHCⅡ类抗原，由α链和β链基因组成。α链基因无多态性；β链基因有丰富的多态性包括：一个编码信号序列区外显子；二个编码细胞质区外显子；编码非多态性β2免疫球蛋白的区域；编码β蛋白和肽结合区的多态性区域以及3'-UTR区的编码外显子。鸡B-L基因与体液免疫关系密切，对MD、球虫病等多种疾病有抗性[3]。

Pharr等[10]通过对B-L基因表达的研究，证明不同品种同一品系B2、B5、B13、B15和B21单倍型鸡的B-L基因表达程度不同，且对MD抗性也不相同，说明B-L基因多态性与MD抗性相关；Niikura等[11]通过对MDV不同编码蛋白与宿主蛋白交互作用的研究，发现只有B-L基因的β链基因编码的蛋白是与MDV有交互用，表明β链是决定MD抗性的主要影响因素。

随着对鸡B-F和B-L基因研究的深入，Fulton等[12]在总结前人研究的基础上进行了鸡MHC分子基因型鉴定，通过多个研究机构长期隔离培育的不同品系MHC纯合子单倍型鸡群为研究材料，对B-F和B-L基因区域间微卫星位点LEI0258和MCW0371分别设计引物，通过其PCR产物不同来确定大多数标准单倍型。LEI0258的PCR目的片段从182到552 bp，与其对应的个单倍型如图1，MCW0371的PCR目的片段从200到209 bp。

图1 LEI0258微卫星位点PCR产物与部分单倍型

通过结合分析LEI0258和MCW0371微卫星位点PCR目的产物，Fulton确定了鸡的各主要标准单倍型，各单倍型目的片段大小详见表1。而与MD抗性相关的B2、B6、B5、B13、B19和B21单倍型，也可以通过此法进行区分。

表1 LEI0258和MCW0371的PCR目的产物与各标准单倍型

1.3 B-G基因

B-G基因包括3'-UTR区、5'-UTR区和五个外显子，其外显子包括：一个编码信号肽的外显子；一个编码胞外区显子；一个编码胞内区外显子；一个编码跨膜区外显子以及一个编码链接区外显子。由于鸡红细胞表面B-G抗原具有显著的多态性，早期学者以血清型不同来鉴别单倍型的不同，并成功选育出了抗MD鸡群。但B-G抗原只能协助MHC I和II类抗原进行体液免疫应答无特定MD抗性，因此越来越多的学者已不再将其作为MD抗性基因。

1.4 Rfp-y基因

Rfp-y基因与B复合体相似，二者虽然位于同一条染色体上，但无遗传上的联系。Tanja等[13]在对黑琴鸡Rfp-y基因研究时，发现Rfp-y基因表达量的不同对肿瘤发生率有影响，由此推断Rfp-y基因可能与MD抗性相关。但在Cornell品种抗MD的N系和易感P系鸡群及其他几个品种中，并未表现出Rfp-y基因对肿瘤发生率的影响。因此，Rfp-y基因与MD抗性是否有关尚无明确定论。

2 生长素（GH）基因

鸡GH基因由五个外显子和四个内含子组成，外显子稳定而内含子易突变，故推测内含子是其表达的主要影响因素。GH有促进鸡生长发育和免疫调节的作用，研究发现MDV抗性鸡体型通常较小，表明GH分泌水平有可能与MDV复制或肿瘤的形成相关。Liu[14]利用酵母双杂交试验、免疫组织试验和间接免疫荧光试验证实GH基因与MD抗性相关；Sarson等[15]在对MD抗性和易感鸡的GH基因转录分析时，发现GH基因表达存在差异，并由此推断其为MD抗性基因，但对MD抗性有多大，仍需要进一步研究。

3 数量性状位点（QTL）

QTL是指一个性状由多个基因决定，每个基因对此性状影响都是微效的。McElrov等[16]利用2个MD病死率不同的鸡群杂交得到F1代，再将F1代回交，对F1代回交得到的鸡群经MD疫苗免疫后，通过选择性DNA池技术选出81个微卫星位点进行测定，发现了17个与MD抗性有关的微卫星位点；Heifetz等[17]在对包括鸡2/3基因图谱的198微卫星位点研究时，发现了15个与MD抗性相关的非MHC染色体区域，它们分别位于1、2、3、4、5、7、8和9号染色体以及Z染色体上。

4 其他基因

Li等[18]通过对MD易感鸡与抗性鸡的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因进行酶切，得到7个等位基因型出现频率存在差异；Kaiser等[19]通过对ADOL品系MD易感和抗性鸡脾细胞中IL-6和IL-18的mRNA表达水平的研究，发现易感鸡表达水平远高于抗性鸡，表明IL-6和IL-18与MD抗性密切相关；Fei等[20]通过对RCS品系MD易感和抗性鸡感染MDV后，发现易感鸡与抗性鸡的DNA甲基转移酶基因3a和3b表达量存在差异，说明它们可能与MD抗性相关。但上述结果是否适应于鸡的大多数品种，还有待研究。

5 结语

与鸡MD抗性相关的多个基因中，MHC的B-F和B-L基因无疑是MD抗性最主要的影响因素，非MHC基因对MD抗性通常仅表现在几个鸡群中且同一基因在不同品系中差别较大。因此，先前的学者也都将研究重点放在了B-F和B-L基因上，特别是Fulton通过B-F和B-L基因区域间微卫星位点PCR产物来区分不同的单倍型，为我们研究武定鸡MD抗性相关基因提供了新思路。但研究者们往往只注重对其中一个基因的研究，同时又常忽略非MHC基因的影响，对鸡MD抗性相关基因的认识始终没有形成一个完整的体系。由此可知，综合考虑各相关基因对MD抗性的影响将是下一步研究趋势，而武定鸡由于其品种和生长环境的独特性，以其作为研究对象更有生物学意义。

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