柱前衍生化液相色谱串联质谱法测定葡萄中单氰胺的含量

王旭群　赵华锋　周嘉明　罗司玉

摘要：目的：建立以柱前衍生化高效液相色谱串联质谱法检测葡萄中单氰胺的含量；方法：衍生化试剂为丹磺酰氯，色谱柱为Waters BEH C18，流动相为甲醇和0.1%甲酸水溶液，进行梯度洗脱，流速为0.3mL /min，采用UPLC-MS/MS多反应监测（MRM）正离子模式测定，外标法定量；结果：单氰胺最低检测浓度为0.02mg/kg，在0.02，0.04，0.1mg/kg3个添加水平下，平均回收率为76%～86%，相对标准偏差为1.9%～3.0%。

关键词：单氰胺 葡萄 柱前衍生化 高效液相色谱串联质谱

中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）08-0061-02

单氰胺化学名称为氨基氰，是良好的植物生长调节剂、杀菌剂、杀虫剂、脱叶剂，可以打破葡萄类和落叶类水果的休眠期[1]，从而促使它们提前开花、结果和成熟，单氰胺在农业生产中的应用十分广泛[2]。单氰胺在水果作物中的广泛应用，导致其可能残留在水果中，单氰胺对人类健康有许多潜在的危害，GB 2763-2014食品安全国家标准食品中农药最大残留限量中规定了葡萄中的最大残留限量为0.05mg/kg，因此迫切需要葡萄中单氰胺的痕量检测方法。

单氰胺分子量小、极性大、易挥发的特点，给单氰胺的检测带来了极大的困难。目前单氰胺的检测还没有国家标准和行业标准，关于单氰胺残留检测方法的报道也很少[3]。本文首次建立了柱前衍生液相色谱-串联质谱法测定葡萄中单氰胺残留量的检测方法，其灵敏度和精密度满足残留分析的要求，为评价葡萄的食用安全性提供了检测依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

单氰胺标准品（98%，上海安谱科学仪器有限公司）；甲醇、丙酮、甲酸（均为色谱纯）；碳酸钠、碳酸氢钠、丹磺酰氯（均为优级纯）；超高效液相色谱-质谱/质谱联用仪（Waters I-Class液相- XEVO TQ质谱）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；离心机（CTK80，湘仪离心机仪器有限公司）；

1.2 仪器条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：Waters UPLC BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm）；色谱柱温度：40℃；流动相A：0.1%甲酸/水；流动相B：甲醇；流速：0.3mL/min；进样量：5μL。

1.2.2 质谱条件

电喷雾正离子（ESI+）；母离子：276.2；定量离子：156.2；定性离子：171.2；锥孔电压：32V；定量、定性离子的碰撞能量分别为30、20eV。

1.3 标样溶液的配制

精确称取单氰胺标准品0.01g（精确至0.00001g），用水溶解并定容至100mL，制得100μg/mL标样溶液，备用。临用前根据需要用50%甲醇/水稀释成不同浓度的标样工作液。

1.4 样品预处理

准确称取5.00g已粉碎均匀的葡萄样品于50mL的离心管中，加入25mL甲醇，均质2min，10mL甲醇分两次清洗均质棒，5000r/min离心5min，上清液转移到 50mL的容量瓶中，并用甲醇定容到50mL，混匀，从容量瓶中准确吸取5mL至10mL的具塞刻度试管中，加入2mL 0.1M碳酸钠、碳酸氢钠混合溶液，1mL1%丹磺酰氯丙酮溶液，混匀后50℃水浴振荡反应1小时，冷却至室温，用甲醇定容到10mL，混合均匀后用0.22μm的滤膜过滤，待测。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的确定

2.1.1衍生化条件的确认

由于单氰胺分子量小、极性大、易挥发的特点，导致单氰胺无法直接测定，因此必须进行衍生化反应后才能进行检测，本次实验尝试采用可以和伯胺进行反应的丹磺酰氯作为衍生化试剂，反应产物经LCMSMS分析测定。

2.1.2 净化条件的确定

单氰胺结构中含有氨基，属于碱性化合物，而且极性较强，于是考虑采用MCX、C18、Carb固相萃取小柱进行净化，结果显示MCX小柱回收率较低，保留作用较弱，而C18和Carb固相萃取小柱净化效果较差，考虑效率和成本，采用稀释后直接衍生化反应，由于LCMSMS仪器灵敏度好，采取样品稀释20倍后上机测定，回收率较好，而且完全满足限量值的要求。

2.2 仪器条件的确定

2.2.1 质谱条件的优化

衍生质量浓度为0.5mg/L的单氰胺的标准溶液，衍生产物分子量为275，质谱通过针泵连续进样，采用MS SCAN方式进行扫描，调节锥孔电压，得到较强的[M+H]峰母离子276.2，对选定的母离子进行子离子扫描，调节碰撞能量，得到丰度较好的2個子离子，分别为156.2、171.2，根据MRM的色谱峰形及灵敏度，确定156.2为定量离子，171.2为定性离子。

2.2.2 液相条件的优化

单氰胺衍生后的化合物，极性减弱，可以采用反相色谱柱C18进行分离。流动相采用甲醇和0.1%甲酸/水，梯度洗脱，调整使保留时间适中且基质影响小，最终确定梯度洗脱程序。

2.3 校准曲线及最低检测限

衍生单氰胺浓度为0.0002、0.001、0.005、0.02、 0.1mg/L的系列标准溶液，以衍生产物的峰面积、质量浓度为纵、横坐标，绘制标准曲线，表明在0.0002～ 0.1mg/L浓度范围内，线性关系良好（r2=0.9997），可以做定量分析。

对阴性葡萄样品添加0.02mg/kg的浓度水平，信噪比S/N为18.5，所以最低定量检测浓度定为0.02mg/kg。

2.4 回收率与精密度

在葡萄的空白试样中添加0.02、0.04、0.1mg/kg三个浓度水平的单氰胺标准溶液，分别进行5次平行测定，从结果看出单氰胺的平均回收率在78%～95%，相对标准偏差为2.9%～5.2%。

2.5 实际样品的检测

按照本方法，分别检测了三种不同产地的葡萄样品中单氰胺的残留，结果表明葡萄中的单氰胺未检出（<0.02mg/kg）。

3结语

本文建立了柱前衍生化液相色谱串联质谱法测定葡萄中单氰胺残留量的分析方法，速度快，准确度高，灵敏度好，适用于单氰胺的安全性评价。