HPLC测定喉症丸中蟾酥的含量

周月玲

摘要：目的：建立喉症丸中蟾酥的主要成分华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量测定方法，通过测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量对其质量进行控制；方法：采用高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPL-C)，选用色谱柱为Hypersil-C18柱（250mm×4.6mm，5?m），流动相为乙腈-水（50:50）；柱温为20℃，流速为0.5ml•min-1；测定波长为296nm；进样量为10μL。结果：华蟾酥毒基进样量在0.101~1.2625μg(r=0、999993)范围内线性关系良好;平均回收率(n=6)为99.07%,RSD为0.37%。酯蟾毒配基进样量在0.10118~1.26475μg(r=0.999996)范围内线性关系良好;平均回收率(n=6)为99.137%,RSD为0.38%。结论：该方法简便、灵敏、准确，利用高效液相色谱法测定喉症丸中蟾酥的含量，可以为喉症丸的定量分析建立标准。可用于喉症丸的质量控制。

关键词：喉症丸；蟾酥；华蟾酥毒基；酯蟾毒配基；HPLC

【中图分类号】R 927 【文献标识码】B 【文章编号】1672-8602(2014)05-0294-02

1 前言

本文建立了喉症丸中蟾酥含量测定的高效液相色谱法，该法具有分离效果好、实验结果表明,本法简便、快捷,准确度高,专属性强,重现性好等优点，可用于该产品的质量控制。

2 仪器与试药

Agilent1200LC全自动高效液相色谱仪，G1311A四元泵，G1311A自动进样器，G1316A柱温箱，AgilentG1313A可变波长紫外检测器，Agilent1200化学工作站；AL204型电子天平；MX5型百万分之一电子天平；KQ-600DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；

乙睛为色谱纯；甲醇为分析纯；水为去离子水。

对照品：华蟾酥毒基对照品，脂蟾毒配基对照品。由中国药品生物制品检定所提供。

喉症丸样品由广州白云山敬修堂股份有限公司提供。

3 方法与实验

3.1 色谱适应性实验：

色谱柱为HypersilODSC18柱（250mm×4.0mm，5μm，依利特），乙腈-水（50:50）为流动相，流速为0.5ml•min-1，检测波长296nm，进样量为10μl柱温为20℃。理论塔板数应不低于4000。

3.1.1 对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷减压干燥24h的华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品各50mg，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度制成每1ml含华蟾酥毒基50μg、脂蟾毒配基50μg的溶液，即得。

3.1.2 供试品溶液的制备：

取本品适量，研细，取0.6175g，精密称定，置25ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声提取1h，取出，放冷至室温，再称定重量，加甲醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

3.1.3 阴性对照溶液的制备：

取除去蟾酥的其他处方药材，按样品制备方法制成阴性样品，按"3.1.2"项下方法制成阴性液。

分别取阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液各10μL,按照上述色谱条件进样测定,结果供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处有一致的色谱峰,华蟾酥毒基和脂蟾毒配基色谱峰与其他组分达到基线分离，阴性溶液在与对照品溶液相同的保留时间处无吸收峰，阴性样品不干扰样品测定。

A

B

C

A喉症丸供试品液相色谱图，B华蟾酥毒基与脂蟾毒配基对照液相色谱图，C缺蟾酥阴性对照液相色谱图

图2.1 缺蟾酥阴性样品、华蟾酥毒基与脂蟾毒配基对照品及喉症丸HPLC色谱图

3.2 方法学考察

3.2.1 线性范围考察：

分别精密吸取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品的混合溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25μl，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，经线性回归，得华蟾酥毒基回归方程为：Y=37.319476X-0.528097，r=0.999993；脂蟾毒配基回归方程为：Y=37.213288X-3.842857，r=0.999996。结果表明华蟾酥毒基在0.101~1.2625μg范围内线性关系良好；脂蟾毒配基在0.10118~1.26475μg范围内线性关系良好。结果见表1，图1。

表1 华蟾酥毒基的线性范围

进样量（μl） 2 5 10 15 20 25

Y 75.10196 185.07298 372.14923 559.16516 747.03766 931.90411

回归方程 Y=37.319476X-0.528097，r=0.999993

图1 华蟾酥毒基与脂蟾毒配基校正曲线

3.2.2 精密度试验：

精密吸取同一供试品溶液10μL,连续进样6次,测得峰面积,计算华蟾酥毒基、酯蟾毒配基RSD分别为0.68%和0.62%。结果显示华蟾酥毒基和脂蟾毒配基精密度良好。

〖HJ1.4mm〗

3.2.3 稳定性试验：

取同一供试品溶液分别于0、2、4、8、24h进样10μl，测定华蟾酥毒基峰面积。24h内基本无变化。测得华蟾酥毒基峰面积的平均值为462.77363，RSD为0.68%，脂蟾毒配基峰面积的平均值为206.937276，RSD为0.57%，其结果显示喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基24h内稳定性良好。

3.2.4 重复性试验：

取同一批号（批号：H10033）喉症丸按供试品溶液制备方法制备5份供试样品，分按含量测定项下方法测定，测得华蟾酥毒基峰面积的平均值为464.1008，RSD为0.68%，脂蟾毒配基峰面积的平均值为209.0346，RSD为0.57%。

3.2.5 回收率试验：

取批号为H10034的喉症丸，粉碎为粉末约0.6175g，精密称定，共6份，置带塞的锥形瓶中，各精密加入浓度为0.125mg/mL的华蟾酥毒基和0.055mg/mL的脂蟾毒配基混合对照液10mL，按3.2.2供试液制备的方法制成加样供试品溶液。测得样品中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。分别计算回收率。

结果显示华蟾酥毒基回收率为99.07%，RSD=0.37%<3%；脂蟾毒配基回收率为99.17%，RSD=0.38%<3%。试验结果进一步表明所建立的方法加样回收率较高，符合含量测定要求。

4 结果

本次实验结果显示，采用Agilent1200LC全自动高效液相色谱仪，HypersilODSC18柱（250mm×4.0mm，5μm，依利特）为色谱柱，乙腈-水（50:50）为流动相，流速为0.5ml•min-1，检测波长为296nm，进样量为10μl，柱温为20℃，高效液相法测定喉症丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。结果华蟾酥毒基进样量在0.101~1.2625μg(r=0.999993)范圍内线性关系良好;平均回收率(n=6)为99.07%,RSD为0.37%。酯蟾毒配基进样量在0.10118~1.26475μg(r=0.999996)范围内线性关系良好;平均回收率(n=6)为99.17%,RSD为0.38%。而且该方法简便快速重复性好，稳定性高，精密度强。从理论上来说，HPLC法测得的结果准确可靠，减少了薄层扫描法提取过程中产生的误差，缩短了提取时间，而且HPLC法具有较高的分离效率和较快的分析速度，分离出制剂中的蟾酥的含量，较好地控制了制剂的质量；从企业的经济考虑，运用高效液相色谱法，提高了生产效率，方法简便快速，缩短了提取时间，减少了试剂的用量，从而又降低了成本。故此方法可以作为喉症丸中蟾酥含量测定的方法。

5 讨论

本实验中曾尝试几种不同型号的色谱柱,其结果供试品分离效果均不理想,干扰较大,两组分保留时间相差较短,主峰拖尾较严重等问题。结果以本实验中采用的HypersilODSC18柱分离效果为佳,杂质峰不干扰华蟾酥毒基和醋蟾毒配基的峰形,且二者能达到完全分离,保留时间适中,取得了较满意的分离效果。

根据文献报道[10]，配制一定浓度的华蟾酥毒基对照品溶液、脂蟾毒配基对照品溶液及二者的混合对照品溶液,在200~400nm波长处进行扫描,结果表明：华蟾酥毒基对照品在294nm处有最大吸收,脂蟾毒配基对照品在298nm处有最大吸收,二者混合对照品在296nm处有最大吸收,故确定检测波长为296nm。与文献[3]报道一致。又根据中国药典2010年版一部蟾酥含量测定项下规定蟾酥测定波长为296nm,况且在本实验的预实验中采用296nm作为检测波长。试验结果,表明在296nm处,辅料基本没有干扰,故选用296nm波长来测定,结果灵敏、准确。

曾采用中国药典测定蟾酥中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量的流动相0.5﹪磷酸二氢钾-乙腈（50:50）（用磷酸调节pH值为3.2），结果华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的分离度不佳，且操作繁琐。通过查阅文献[16-20],发现曾有人采用甲醇-水-冰醋酸系统、乙腈-0.1%磷酸溶液系统和不同比例的乙腈-水系统。根据实验条件，预实验用乙腈-水（55:45）为流动相进行实验分离度也未达到要求。后来通过参照文献[21]和实验结果的基础上，发现采用乙腈-水（50:50）时，华蟾酥毒基与脂蟾毒配基峰形对称，分离完全，杂质干扰少，基线平直，故采用乙腈-水（50:50）作为流动相。另外，使用乙腈作为流动相还有诸多好处：（1）乙腈HPLC吸收最小（特别是在短波长上小）；（2）UV检测中的梯度基线上乙腈HPLC级产生鬼峰少；（3）乙腈和甲醇分别用同样的比率与水混合时,一般情况下,乙腈的洗脱能力强。

本试验分别用甲醇回流及甲醇超声方法进行提取。结果发现回流提取之后的供试品溶液与超声提取的供试品溶液实验结果并没有明显差别。而且采用甲醇超声提取法，简便，易行，提取效率并未下降且溶液易于滤过，故用该提取方法。

本實验分别对超声提取的时间进行了考察，对供试品溶液分别超声处理20,30,60min按实验项下方法制备所需溶液,并按色谱条件进行测定,结果表明，用甲醇超声30min，提取效率较高并已提取完全，因此确定超声提取时间为30min。

通过在不同的柱温条件下进行试验,开始用25℃进行试验时发现华蟾酥毒基的色谱峰已经分离完全，分离度高。但是脂蟾毒配基与旁边的干扰峰分不开。经过摸索发现柱温20℃时分离度好,分离时间适中,可保证在正常时间内完成检测任务。

结束语

由于中药成分比较复杂，使用高效液相色谱分析法作为其质量控制的主要方法，这种测量方法分离效果好，分析速度快，灵敏度高，准确，操作自动化，简单方便,是对中药进行成分分析的一种极有价值的分析技术。实验中也可以体验到方法的优势。以前曾用TLC－UV法测定蟾酥的含量操作繁琐，准确性差，所以采用高效液相色谱法，可以为喉症丸的质量控制提供了快速、准确的测定方法。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010版）一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010:265.

[2] 高学敏.全国高等中医药院校规划教材《中药学》[M].北京：中国中医药出版社，2007:512-513.

[3] YehJY，HuangWJ，KanSF，eta1．Effectofbufalinandcinobufaginontheproliferationofandrogendependentandindependentp

rostatecancercells[J]．Prostate，2003，54(2)：112-124．