日粮核苷酸对减少由T—2毒素和呕吐毒素诱导的鸡白细胞DNA损伤的作用

贺淼

摘 要：本研究旨在通过测定T-2毒素和呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）对脾脏白细胞DNA片段化和鸡氧化应激的影响，以评估日粮核苷酸对毒素诱导的DNA损伤的修复潜力。选用雄性肉鸡，分别饲喂添加或不加核苷酸的含有10 mg/kg的T-2毒素或呕吐毒素的饲粮。试验进行17 d后，利用“彗星”分析法（又叫单细胞凝胶电泳）检测脾脏白细胞的DNA损伤，通过测定血浆和肝脏中的丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量及血浆中的总抗氧化水平（Total Antioxidant Status，TAS）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）含量来评判机体的脂质过氧化程度，肝毒性通过血浆中肝酶（谷丙转氨酶ALT，谷草转氨酶AST和谷氨酰转肽酶GGT）水平来评定。T-2毒素和呕吐毒素能诱导的鸡脾脏白细胞DNA的片段化，补充核苷酸只能减少T-2毒素引起损伤的程度。相比于空白对照组，饲粮中含有T-2毒素的添加或不添加核苷酸的两个处理组肉鸡的TAS和AST显著减小。饲粮中含有T-2毒素和呕吐毒素的处理组肉鸡血浆和肝脏组织中的MDA含量与对照组相比没有显著性差异。当肉鸡饲喂含有霉菌毒素的饲粮时，日粮核苷酸的补充并不影响机体MDA的生成。结果发现日粮核苷酸对削弱免疫细胞中因T-2毒素诱发的DNA损伤具有功效，这表明补充日粮核苷酸对霉菌毒素中毒的免疫系统的改善具有有益作用。

关键词：霉菌毒素，T-2毒素；呕吐毒素；核苷酸；DNA损伤；脂质过氧化

中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2014）05-0070-04

1 引言

镰刀菌属霉菌产生的单端孢霉烯类毒素，如T-2毒素、HT-2毒素、呕吐毒素和雪腐镰刀菌烯醇对谷物食品和饲料的污染，对于北温带地区的国家生活的人类或者动物是一个健康威胁（Hussein和Brasel，2001；Creppy，2002）。

单端孢霉烯类毒素所引起的慢性中毒状主要表现有：厌食症，体增重降低，营养效率减小，内分泌紊乱，免疫力减弱（Larsen等，2004）。相比于其他物种，家禽对单端孢霉烯类毒素敏感性较弱。当饲料中的呕吐毒素水平超过5 mg/kg将会对动物产生不利影响（Danicke等，2001），而超过10 mg/kg将导致动物拒食和体增重降低（Danicke等，2003）。当饲料中的呕吐毒素水平达到10 mg/kg时，饲养肉鸡的肠道功能会减弱（Awad等，2004），肌胃、法氏囊和心脏的相对器官重量增加（Kubena等，1997），体液免疫受到影响（Oswald等，2005），并且血液生化指标的参数改变（Kubena等，1988）。与呕吐毒素相似，低剂量T-2毒素会导致动物生产性能下降和严重的口腔疾病，增加肌胃相对重量，降低法氏囊的相对重量（Kubena等，1994；Raju和Devegowda，2000；Garcia等，2003）。Grabarevic等（1992）報道了感染了T-2毒素后的鸡在心脏，肝脏，十二指肠和肾脏组织病理学变化，而且Boonchuvit等（1975）报道了感染了T-2毒素后的鸡会导致机体产生免疫抑制。饲喂被镰刀菌属霉菌毒素污染的谷物类原料比例过高的日粮，肉鸡的B、T淋巴细胞的比例会降低，但不影响血清免疫球蛋白浓度（Swamy等，2004）。

单端孢霉烯类毒素的毒性是由不同的作用机制所诱导的。主要作用机理在于：单端孢霉烯类毒素能结合在真细胞的60 S核糖体亚基上，从而导致蛋白质、DNA和RNA的合成受到抑制（Eriksen和Pettersson，2004）。此外，有研究表明单端孢霉烯类毒素会刺激机体产生脂质过氧化，引起细胞膜受损和DNA损伤（Atroshi等，1997；Leal等，1999；Vila等，2002；Minervini等，2005）。由于自身的氧化途径的激活或DNA加合物的形成及遗传单链和双链的DNA断裂，并没有研究表明T-2毒素和呕吐毒素对于家禽具有遗传毒性效应。Rizzo等（1998）和Atroshi等（1997）认为T-2毒素和呕吐毒素主要是通过氧化途径诱导大鼠和小鼠肝脏中的DNA损伤。但是，单端孢霉烯类毒素的遗传毒性仍有待确定。

虽然核苷酸是半必需营养物质，但是当机体处于某种病理条件下，需要大量的核酸和蛋白的合成时，核苷酸会成为人类和动物的必需营养物质，如胃肠道粘膜的损害修复（Yamauchi等，1998；Holen和Jonsson，2004），免疫细胞的快速增殖（Jyonouchi等，1996；Burr-ells等，2001a，b；Cameron等，2001），肝脏和脑组织的康复（Yamamoto等，1997；Perez等，2004）。

由于没有充分的证据表明单端孢霉烯类毒素具有遗传毒性（Tritscher和Page，2004），因此，本研究的目的也在于考察T-2毒素和呕吐毒素诱导鸡体内免疫细胞DNA损伤的潜力，以评估感染鸡机体的氧化状态。关于日粮核苷酸对霉菌中毒症的影响没有研究报道。本研究的一个更深层次的目的在于探讨日粮核苷酸对白细胞中由霉菌毒素诱导的DNA损伤的保护效果，因为核苷酸的这一作用模式可能增加免疫细胞的增殖，并优化免疫系统的功能。

2 材料和方法

2.1 试验动物和试验日粮

试验选用20日龄的罗斯308雄性肉鸡，单笼饲养，环境温度控制在26 ℃，随着动物的生长发育逐渐的调低环境温度，并持续光照。动物自由采食，自由饮水。日粮配方参照NRC（1994）的3～6周龄肉鸡的营养需要进行设计。

试验开始前，将肉鸡随机分为5个处理组（每组10羽），分别饲喂不同饲粮：（1）对照组——饲喂不添加霉菌毒素和核苷酸的基础日粮；（2）DON组——饲喂在基础日粮中添加 10 mg/kg呕吐毒素的饲粮；（3）DON+组——饲喂在基础日粮中添加10 mg/kg呕吐毒素和2 mg/kg核苷酸的饲粮；（4）T-2组——饲喂在基础日粮中添加10 mg/kgT-2毒素的饲粮；（5）T-2组+——饲喂在基础日粮中添加10 mg/kgT-2毒素和 2 mg/kg核苷酸的饲粮。每周记录一次动物的耗料量和活体增重。在试验期的第17天，屠宰试验肉鸡，并采血，采集脾脏和肝脏组织样品，并考察肝脏、脾脏、脑、肾脏、心脏、肌胃、小肠和法氏囊的相对重量。

2.2 霉菌毒素和核苷酸

购买的T-2毒素和呕吐毒素的真菌培养物：T-2毒素真菌培养物中含T-2毒素0.49 %（W/W），呕吐毒素真菌培养物含有1.04 %（W/W）呕吐毒素。核苷酸由瑞士Chemoforma公司提供的ASCOGEN?制剂，含有酵母中提取的RNA、核苷酸、核苷酸前体物、有机酸。

2.3 化学制品

RPMI 1640培养基，Triton X-100，二甲亚砜（DMSO），N-月桂基肌氨酸钠，溴化乙锭，EDTAK3，低和正常熔点琼脂糖购自Sigma（圣路易斯，密苏里州，美国）。丁基化羟基甲苯（BHT），三氯乙酸（TCA），2-硫代巴比妥酸（TBA），乙醇，甲醇和无机盐购自Merck（达姆施塔特，德国）。

2.4 白细胞分析和“彗星”分析法检测DNA

检测鸡脾脏中分离的白细胞的DNA片段。脾脏通过80×48 μm孔径的尼龙筛浸于大约5 mL的RPMI 1 640培养基（Sigma R-8 758）中，所得到的混合物转移到1.5 mL离心管和在3 000 r/min下离心5 min。白细胞的沉淀用0.5 mL 10 mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH值为7.2～7.4）混合。“彗星”分析法参照Singh等（1988）进行，并根据Rezar等（2003）的描述进行轻微修改。在Olympus CH50落射荧光显微镜（日本）（200·放大率）与附滨松奥卡1 CCD照相机（日本）被用来检测白细胞的细胞核。图片是由彗星5计算机软件（单细胞凝胶电泳，动力学影像有限公司，2000年，英国）进行分析。DNA损伤程度跟据形成的彗星拖尾形象DNA的百分比和OTM值（Olive tail Moment）来评估。

2.5 丙二醛（MDA）的检测

血浆中的MDA含量的检测方法参照Wong等（1987），并根据Chirico（1994）进行修改通过HPLC检测，肝脏中的MDA含量的检测参照Vila等（2002）。具体步骤见原文。

2.6 谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、总抗氧化水平（TAS）和肝酶检测

红细胞中GPx活性的检测方法参照Paglia和Valentine（1967），血浆TAS的检测方法参照Miller和Rice Evans（1996），样品检测按照试剂盒的说明进行操作。血浆肝酶活性的检测使用由默克（德国达姆施塔特）提供的试剂盒进行分析：ALT（Granutest? 3，12166），AST（Granutest? 3，12150），GGT（Granu-test? 3，12189）。

2.7 统计分析

试验数据采用SAS/STAT模块（SAS 8e，2000；SAS Inc.，Cary，NC，USA）的GLM模型进行分析，结果以LS-Mean±SEM（最小二乘均数±标准误）表示，组间采用T检验进行多重比较，以P<0.05作为具有显著性差异。

3 结果

3.1 体增重、采食量和器官的相对重量

饲粮中含有T-2毒素的处理组的体增重比对照组低 47 %（表1）。饲喂含有T-2毒素饲粮的处理组生长受阻是由于采食量的显著降低引起的。与饲喂含量T-2毒素的饲粮相比，饲喂含有10 mg/kg的呕吐毒素饲粮对采食量和体增重的降低处于一个较小的范围（表1）。当饲粮被T-2毒素和呕吐毒素污染时，补充日粮核苷酸并不会提高动物的采食量和体增重。

饲粮中含有T-2毒素的处理组和T-2毒素+核苷酸的处理组肉鸡的肾脏、肌胃、脑和小肠的相对重量（g/100g BW）增加（表2）。在饲粮含有T-2毒素处理组中，补充核苷酸能增加17 %的大肠相对重量，减少11 %的心脏相对重量。各霉菌毒素处理组间的肝脏、脾脏、法氏囊和胰脏的相对重量没有差异（数据未列出）。无论添加或不添加核苷酸，呕吐毒素处理组肉鸡肾脏、大肠、肌胃和脑的相对重量并没有显著性效应。

3.2 脾脏白细胞的DNA损伤

DNA损伤程度根据形成的彗星拖尾形象DNA的百分比和OTM值（Olive tail Moment）来表示，OTM值表示尾部DNA占总DNA的百分比与头、尾部中心间距的乘积，OTM值越大表示DNA损伤程度越大（Olive等，1992）。与对照组相比，饲粮中含有T-2毒素和呕吐毒素都会显著提高拖尾DNA的百分比。补充日粮核苷酸只显著降低T-2毒素组的拖尾DNA百分比（图1）。DON、DON+组与对照组间的OTM值没有差异，然而与对照组相比，T-2组显著提高了OTM值，但补充日粮核酸的T-2+组能将OTM值又降低到与对照组相同的水平 （图2）。

3.3 氧化状态和肝酶活性

与对照组相比，饲粮中含有T-2毒素和呕吐毒素的处理组血液和肝脏中的MDA含量没有显著差异；但是T-2组和DON组的血液和肝脏中的MDA含量具有显著差异（表3）。霉菌毒素处理组间肝脏MDA含量的差异性很大。补充日粮核苷酸并不影响肝脏MDA水平。无论添加或不添加日粮核苷酸，饲粮中含有T-2毒素的處理组肉鸡血液TAS都会降低，但是饲粮中含有呕吐毒素并不会改变所饲养肉鸡血浆TAS（表3）。另一个体现机体氧化应激的指标——GPx活力在各个处理组间的差异不显著。

血液中的肝酶ALT和GGT水平是不一致的（表4）。可以发现无论添加或不添加日粮核苷酸，饲粮中含有T-2毒素的处理组肉鸡血浆AST活性会显著降低。

4 讨论

由于T-2毒素和呕吐毒素的遗传毒性的确切的机制没有得到深入地研究，仍不清楚是哪种单端孢霉烯类霉菌毒素造成DNA的断裂。他们（霉菌毒素）可能会造成DNA结构被打破，或者通过不同后生的机制（例如DNA碱基氧化或甲基化）来发挥作用；DNA碱基的氧化或甲基化会改变基因的表达和细胞信号传导，从而导致细胞增殖受到抑制，甚至导致细胞凋亡。在“彗星”试验中，那些被检测到的DNA碎片也是由于氧化甲基的切除和修复造成的结果。本研究表明T-2毒素和呕吐毒素会造成鸡脾脏白细胞DNA断裂，断裂程度是由“彗星”实验检测到的拖尾DNA的百分比表示。然而另外一个也是经常用来表示DNA断裂程度的参数——OTM值，在本研究结果也反映了只有T-2毒素处理会造成DNA损伤。关于这两个指标（拖尾DNA百分比和OTM值）到底是那个描述DNA损伤程度更好，一直没有统一的意见。拖尾DNA百分比是一个基础而又最有效的参数，因为它能够与断裂频率之间建立线性关系，并且尽可能地使鉴别的DNA损伤程度控制一个最广泛的区间（0 %～ 100 %），但是尾距与损伤量之间并不遵守线性关系（Collins，2004）。然而很多科学家更喜欢OTM值，因为这个参数是根据很多基本参数计算出来的综合指标（Olive等，1992）。Atroshi等（1997）和Rizzo等（1998）的报道能够支持本研究的发现，前者报道了饲喂T-2毒素会增加小鼠肝脏DNA的损伤程度，后者检测到T-2毒素和呕吐毒素对大鼠肝脏细胞具有遗传毒性的效应。在本研究中T-2毒素能诱导更大程度的DNA损伤，T-2毒素也被证实不仅仅具有比呕吐毒素更强的细胞毒性（Nasri等，2006），而且具有更强的遗传毒性。大量研究表明T-2毒素和呕吐毒素会造成机体组织自由基的生成，从而引起脂质过氧化（Karppanen等，1989；Rizzo等，1994；Guerre等，1998；Leal等，1999；Vila等，2002）。本研究的结果表明，T-2毒素和呕吐毒素不改变血浆中的MDA（脂质过氧化指标）的含量，并且对肝脏MDA含量产生不同的作用，这与以前关于脂质过氧化的研究发现并不完全一致。值得一提的是，与本研究相比，以前关于T-2毒素和呕吐毒素诱导脂质过氧化和DNA损伤的研究中所饲喂的霉菌毒素剂量更高。Schuster等（1987）推断T-2毒素不会影响大鼠肝脏中的硫代巴比妥反应物质的生成，这与本研究的结果相似。T-2毒素处理组肉鸡血液中的TAS显著减低，表明T-2毒素会诱导机体产生氧化应激，但是这点不被GPx活力的检测结果所支持。在另外一个方面，饲粮中添加10 mg/kg的呕吐毒素并不改变机体的TAS和GPx活力。

霉菌中毒症引起血浆中肝酶（ALT，AST和GGT）含量的增加，被认为是因为造成肝细胞恶化之后造成肝酶泄漏，从而进入血液循环。由于毒素处理组的血浆肝酶含量太低不足以说明肝毒性的产生，并且肉鸡的肝脏相对重量与对照组相比没有差异，因此，可以假定本研究中肝脏并没有受到激烈的损伤。Danicke等（2003）和Harvey等（1997）的报道均能支持本研究的试验数据，前者报道了饲粮中添加21 mg/kg的呕吐毒素对鸡血液肝酶水平没有显著影响，后者报道了呕吐毒素处理对肉鸡的能表明肝脏损伤的血清参数并没有影响。

由于毒素处理组的脾脏和法氏囊相对重量发生改变，可以预测这是免疫器官产生故障的一个信号。已有报道指出霉菌毒素对免疫器官的存在这种影响：饲喂T-2毒素的小鼠试验（Vila等，2002）和饲喂呕吐毒素的鸡试验（Danicke等，2003）。目前的研究表明T-2毒素和呕吐对脾脏和法氏囊相对重量没有影响。然而，无论是否额外补充日粮核苷酸，T-2毒素处理组肉鸡的肌胃、小肠、肾脏和脑的相对重量提高，可以认为是由于这些器官受到刺激或作用功能加剧造成的结果。在Chi等（1977），Harvey等（1997）和Danicke等（2003）的试验研究中，当添加呕吐毒素或T-2毒素时，心脏的相对重量增加或不变，这与本研究中T-2毒素处理减少了心脏相对重量的结果相矛盾。显然，那些文献和本研究中所用的单端孢霉烯类霉菌毒素的剂量远超出了能改变器官相对重量的剂量（Kubena等，1997；Harvey等，1997）。

目前的研究结果表明，核苷酸在被T-2毒素污染了的饲粮中添加是能够削弱动物体内白细胞DNA由这种霉菌毒素诱导的损伤。核苷酸在被呕吐毒素污染了的饲粮中添加也能观察到具有相同的趋势，虽然这种差异并不具有显著性。T-2毒素比呕吐毒素表现出更强的遗传毒性潜力，因而可能补充的核苷酸在DNA损伤程度更大时表现出的效果更好。Salobir等（2005）也得到了类似的研究结果，他发现核苷酸对高脂肪的摄入量引起的猪淋巴细胞DNA氧化损伤具有预防作用。高脂肪摄入量会诱导氧化应激（自由基的形成），这将这引起淋巴细胞DNA断裂，而核苷酸的补充能够阻止这种现象的发生。核苷酸本身不是已知的具有抗氧化特性的物质，它对氧化应激指标的改变不能被预期。在阻止T-2毒素或嘔吐毒素介导的脂质过氧化的过程中，核苷酸作用方式可能是通过改善特定RNA的合成，这种特定的RNA又将负责特定酶的合成，这种特定的酶对抗氧化应激又是必需的。补充了核苷酸的T-2毒素处理组TAS和GPx活力过低，不能支持这一假设。此外，在T-2毒素和呕吐毒素处理组中补充核苷酸并没有改变这两种霉菌毒素对AST、ALT和GGT水平的影响。

本研究的结果表明，与能代表B型的单端孢霉烯类霉菌毒素——呕吐毒素相比，A型的单端孢霉烯类霉菌毒素——T-2毒素对鸡脾脏白细胞更具遗传毒性。并不排除氧化途径可能仅仅是镰刀菌毒素诱导DNA断裂的作用机制之一。总之，本研究所得的结果表明，日粮核苷酸能够削弱由T-2毒素作用造成免疫细胞DNA损伤的风险，这表明补充日粮核苷酸可能对霉菌毒素中毒的免疫系统的改善具有有益作用。关于核苷酸在修复霉菌毒素诱导的DNA损伤中的作用需要更深入的研究。□□

原题名：The role of dietary nucleotides in reduction of DNA damage induced by T-2 toxin和deoxynivalenol in chicken leukocytes（英文）

原作者Franki? T、Pajk T、Rezar V、T. Rezar、A. Levart、J. Salobir