陶氏化学格利特消毒剂GLUTEX GS2对犬细小病毒杀灭效果的测试

李亚雄　仇正兴

摘 要：本研究参照美国国家环境保护局（EPA）关于消毒剂在干燥的非生物表面的抗病毒效果测评方法，评定了美国陶氏化学公司的格利特消毒剂GLUTEX GS2对犬细小病毒的杀毒效力。结果表明：经合成硬水1：256倍稀释的格利特消毒剂GLUTEX GS2，在与干燥处理的犬细小病毒膜充分接触10 min后，病毒活性低于2.5个滴度，表明此消毒剂对犬细小病毒具有杀灭效力，可用于此病毒的日常消毒中。

关键词：犬细小病毒；抗病毒效果；评测；GLUTEX GS2消毒剂

1 实验目的

本测试旨在测评陶氏化学公司生产的格利特消毒剂GLUTEX GS2的杀病毒效力。其方法是，该产品先按要求进行稀释，随后用稀释液处理受病毒污染的物体表面，然后从处理物体表面回收病毒，通过评估回收病毒的传染力确定消毒剂的消毒效率。

2 实验材料和方法

2.1 测试病毒

试验所用犬细小病毒（CPV MLV）由美国康奈尔大学M. J. Appel博士提供。该病毒悬浮液是组织培养基。

2.2 细胞组织培养液和培养基

本研究所用犬肿瘤细胞来自位于美国马里兰州罗克维尔的美国标准菌库（American Type Culture Collection，ATCC）。细胞培养物在添加了10 %（V/V）牛胎儿血清（在56 ℃ 热灭活30 min）、100 单位/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、50 μg/mL庆大霉素、 2.5 μg/mL两性毒素B和25 mM四羟乙基哌嗪乙磺酸的最低必需培养基（Minimal Essential Medium，MEM）中进行常规培养。培养后置于37 ℃含5 %CO2的潮湿空气下的一次性实验室器皿中，制成单层组织培养物。感染病毒后，培养物置于装有相同成分并添加了50 ng/mL（Calbiochem）表皮生长因子。

2.3 试剂

磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）采用Dulbecco和Vogt的方法配制（实验医学杂志[J]. 1954， Vol.99：167-182）。合成硬水在使用当天配制，配制方法参照 AOAC 4.024法{美国[美国公职分析化学工作者协会（AOAC）]，第14版，1984，第70～71页}。

2.4 消毒剂的制备

每份消毒剂在使用当天按照1∶256的比例用1 247 mg/kg AOAC合成硬水进行稀释。

2.5 病毒膜的制备

病毒膜通过将0.2 mL的病毒悬浮液涂复在灭菌的皮氏玻璃培养皿底部制作而成。随后置于室温（约23 ℃）及环境湿度下，避免直接光照直至明显干燥（约45～75 min）。

2.6 用消毒剂处理病毒薄膜

干燥的病毒薄膜在约23 ℃下用2.0 mL消毒剂稀释液（喷雾）处理，使两者保持10 min的充分接触。在接触一定时间后，用橡胶淀帚刮下培养皿底部物质，并立即取一小份病毒-消毒剂混合物加入交联葡聚糖（Sephadex）凝胶过滤柱中，用凝胶过滤法将病毒从消毒剂中分离出。

2.7 病毒对照薄膜的处理

在用消毒剂处理一份病毒薄膜时，另一份相同病毒薄膜用2 mL磷酸盐缓冲生理盐水再次悬浮，随后取一小份混合液加入交联葡聚糖凝胶（Sephadex）过滤柱中。

2.8 交联葡聚糖凝胶过滤（Sephadex Gel Filtration）

交联葡聚糖凝胶过滤按照Blackwell和Chen的改良方法[美国公职分析化学工作者协会杂志53期（1970年）第1229～1236页]进行操作。3 cc交聯葡聚糖柱（LH-60-120）利用磷酸盐缓冲生理盐水保持平衡，离心清除液体中的空隙体积，随后装入约0.6 mL病毒-消毒剂混合液或病毒-磷酸盐缓冲对照混合液，并再次离心。

2.9 病毒回收分析

对每份病毒-消毒剂和对照病毒滤出液进行稀释，接种至细胞培养液中。每份稀释液至少使用4份培养液。接种0.05 mL单层细胞，并在37 ℃下培养1 h。干燥后，加入维持培养基（0.2 mL），并在恒温37 ℃下接种培养液。接种7 d后，记录培养液细胞病变效应。细胞病变效应最终结果见表1。

2.10细胞毒性对照

每份已稀释消毒剂通过交联葡聚糖凝胶过滤，利用磷酸盐缓冲液进行倍比稀释，随后接种于添加病毒消毒剂混合液的细胞培养液中。接种后7 d后，记录细胞培养液的细胞毒性。

2.11 计算方法

采用Reed-Muench法（L. J. Reed和H. Muench. 美国卫生医学杂志[J].1938，Vol.27：493-497），计算以50 %侵染性的log10（TCID50）和毒性（TD50），以表示病毒效价及细胞毒性。

3 实验结果

格利特消毒剂GLUTEX GS2对犬细小病毒的病毒感染性和细胞毒性测定结果见表1。

4 实验结论

陶氏化学公司格利特消毒剂GLUTEX GS2在测试条件下，能有效杀灭犬细小病毒。□□