石竹茎腐病病原菌鉴定与生物学特性研究

郑红莉等

摘要[目的]明确石竹茎腐病病原菌，以期更好地防治此病害。[方法]使用常规植物病理学和分子生物学方法分离和鉴定病原菌，并研究病原菌生物学特性。[结果]石竹茎腐病病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。立枯丝核菌最适生长温度为28 ℃，最适pH为7～8，最适生长的碳源为麦芽糖、可溶性淀粉，最适氮源是蛋白胨；尖孢镰刀菌最适生长温度为28℃，最适pH为7～9，尖孢镰刀菌在果糖和蔗糖中生长速度最快，葡萄糖最不利于其生长，最适氮源为蛋白胨。[结论]立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）共同侵染石竹引起石竹茎腐病。这2种病原菌对环境的适应能力较强。

关键词石竹茎腐病；病原菌；鉴定；生物学特性

中图分类号S681.5文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01674-04

Abstract[Objective] To identify the pathogens and prevent carnation stem rot. [Method] The pathogens were identified and their biological characteristics were studied by molecular biology experimental techniques and phytopathological research methods. [Result] Carnation stem rot was caused by Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum. For Rhizoctonia solani， the optimum growth temperature and pH were 28℃ and 7-8， respectively. The fastest growth rate of the mycelium was achieved under the optimal nutrition such as carbon source for malt sugar and soluble starch， while nitrogen source for peptone. The optimal temperature for Fusarium oxysporum was 28℃ and the pH was 7-9. The mycelium grew fastest in fructose and sucrose and the most unfavorable carbon source was glucose. The optimum nitrogen source for Fusarium oxysporum was peptone. [Conclusion] Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum could infect Dianthus chinensis together and they had strong ability to adapt to the environment.

Key wordsCarnation stem rot； Pathogens； Identification； Biological characteristics

石竹（Dianthus chinensis）是石竹科石竹属花卉，原产我国北方，生长于草原和山坡，花期5～9月。石竹在绿化应用中常大面积栽植组成花境；亦具有药用价值，根和全草均能入药，具有清热利尿、破血通经、散瘀消肿的功效[1]。

石竹性强健，不易染病，关于石竹病害报道较少，而石竹属植物香石竹的病害研究较多，如尖孢镰刀菌引起的枯萎病，菊欧文氏菌引起的立枯菌，单孢锈菌引起的锈病，立枯丝核菌引起的立枯病[2-3]。2012年华南农业大学百花园内大面积暴发石竹茎腐病，严重影响石竹观赏性。

石竹茎腐病发病初期茎基部病斑黄褐色，环绕整个茎基，病部缢缩呈湿腐状，继而茎基部变褐腐烂，病株猝倒枯死，腐烂部位及周围土壤可见菌丝体1材料与方法

1.1材料

病原菌：从石竹茎基部腐烂处分离得到。

培养基：试验用培养基为PDA培养基和Richard培养基。

1.2病原菌的分离培养

在病斑的病健交界处切取大小为5 mm×5 mm的组织块，采用组织分离法进行病原物的分离培养，通过单孢或者单菌丝分离得到纯培养物。将分离物置于4 ℃冰箱中保存备用[4]。

1.3病原菌致病性测定

根据柯赫氏法则，选择健康的植株，将直径5 mm的菌苔贴在刺伤的茎基部，保湿24 h，待植株发病后，再次分离培养病原菌。以清水接种作为对照。

1.4病原菌鉴定

1.4.1病原菌形态学鉴定。

将病原菌接种到PDA培养基平板上，26 ℃恒温培养，观察菌落形态。同時，在显微镜下观察病原菌菌丝形态和孢子形态。

1.5病原菌生物学特性

菌丝生长及产孢量.将纯化保存的病原菌接种至PDA培养基上26 ℃培养3 d，用打孔器取直径5 mm的菌饼接种至测定培养基，培养3 d后用十字交叉法测量菌落直径，分析温度、pH、碳源、氮源对菌丝生长的影响。5 d后，用10 ml无菌水洗脱菌落表面孢子，稀释10倍后用血球计数板测定孢子的浓度，计算每培养皿（直径9 cm）的孢子数量，分析温度、pH对产孢量的影响。

温度：将病原菌接种到PDA培养基后，置于8、12、16、20、24、26、28、32、36 ℃的条件下避光恒温培养。pH：将病原菌接种到pH 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的PDA培养基后恒温避光培养。碳源、氮源分别以Richard培养基为基础培养基，用相同含碳量的葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘露醇和可溶性淀粉替换蔗糖作为碳源，用相同含氮量的磷酸铵、硝酸铵、硫酸铵、脲和蛋白胨替换硝酸钾作为氮源。以上试验每处理3次重复，除温度试验外，其余均在26℃条件下黑暗培养。

值，该研究确定了引起石竹茎腐病病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。在已知的文献中，尚未有对石竹茎腐病的研究，但对于石竹科石竹属香石竹的茎腐病已有报道[7-8]。研究表明，引起香石竹茎腐病的主要病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani AG4HG I）[9]，尖孢镰刀菌引起香石竹的枯萎病[10]。该研究认为尖孢镰刀菌和立枯丝核菌均可侵染石竹引起茎部腐烂。但该研究分离得到的立枯丝核菌是否与香石竹立枯丝核菌为同一个菌丝融合群有待于进一步研究。

立枯丝核菌和尖孢镰刀菌均是土传病原菌，尚无有效的防治措施。为了更好地防治石竹茎腐病，对2种病原菌的生物学特性进行研究。结果表明，立枯丝核菌最适生长温度为28 ℃，最适pH为7～8；尖孢镰刀菌最适生长温度亦为28 ℃，最适pH为7～9。杨子祥等[11]对香石竹立枯丝核菌的研究表明，病原菌最适生长温度为30℃，最适pH为5.5；王辉等[12]的研究表明，25 ℃为尖孢镰刀菌最适生长温度，最适pH为6，最适合尖孢镰刀菌生长的氮源是蛋白胨。之所以存在此差异，可能是由于病原菌来源地不同，各个地区的生态条件存在差异所致。

立枯丝核菌和尖孢镰刀菌对环境的适应能力较强，可以在各种pH土壤中存活，温度适应范围广泛，对营养的需求具有广泛的适应能力，能利用土壤中的各种碳和氮源营养。随病原菌量的不断积累，极易造成大面积发生和流行。种植者应高度重视，提前预防病害发生，合理轮作，同时加强抗病品种的选育。

参考文献

[1] 中国科学院中国植物志编写委员会.中国植物志：第26卷[M].北京：科学出版社，1994：415.

[2] 赵兰枝，蒋学杰，孙丽，等.新乡地区香石竹病害调查与病原鉴定[J].山东林业科技，2005（1）：33-34.

[3] 孔宝华，蔡红，范静华，等.云南省香石竹病害的种类和发生概况分析[C]// 彭友良.中国植物病理学会2006年学术年会论文集.北京：中国农业科学出版社，2006：330.

[4] 方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998：65-125.

[5] 易润华，朱西儒，周而勋.简化CTAB法快速微量提取丝状真菌DNA[J].湛江海洋大学学报，2003，23（6）：72-73.

[6] 张宝俊，李志岗，王建明，等.镰刀菌基因组DNA的抽提及特异片段的扩增分析[J].山西农业大学学报，2006，26（2）：121-124.

[7] TRUJILLO，E E，SHINABUKU R，CAVIN C A，et al.Rhizoctonia solani anastomosis groupings in carnation fields and their pathogenicity to camation [J].Plant Dis，1988，72（10）：863-865.

[8] LO C T，TU C C，TSAI W H.Anastomosis groups and pathogenicity of Rhizoctonia spp.from carnation [J].Plant Pro.Bul（Tai wan），1990，32（2）：158-161.

[9] 李艷琼，杨根华，王宝华，等.云南香石竹立枯病病原苗的鉴定及致病性研究[J].植物物理学报，2008，38（2）：191-202.

[10] 王国良，任善于，应兴德.香石竹萎蔫病病原的初步研究[J].植物病理学报，1998，28（1）：61-65.

[11] 杨子祥，范静华，孔宝华，等.香石竹立枯病菌的生物学特性与药剂筛选[J].云南农业大学学报，2009，24（6）：818-824.

[12] 王辉，孔宝华，李凡，等.香石竹枯萎病菌的生物学特性研究[J].植物保护，2007，33（1）：68-71.