柠檬无菌播种试验

麦丽瑶等

摘要

[目的]研究柠檬[Citrus limon （L.） Burm. f.]种子萌发的适宜处理方法。[方法]以不同种皮剥离程度的柠檬种子（不剥种皮、只剥外种皮、剥除内外种皮）为试材，应用不同消毒剂[4%（V/V）蓝月亮、0.1%升汞]消毒不同时间（7、15、23 min），进行柠檬播种试验。[结果]0.1%升汞消毒8 min的效果优于4% （V/V）蓝月亮消毒15 min，但差异性不大；种子在剥除内、外种皮后萌发率、生长势情况都好于只剥外种皮和未剥除种皮的。[结论]考虑到升汞具有致癌变、致突变性等危害，在试验操作中不提倡使用，故以4%（V/V）蓝月亮处理15 min为柠檬种子消毒的最佳方式。该研究可为柠檬组织培养及柑橘无病毒苗木培育提供参考依据。

关键词柠檬；无菌播种；消毒方法；种皮

中图分类号S666.5文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01639-02

Abstract[Objective] The aim was to study the suitable treatment method of lemon seeds germination. [Method] Lemon seeds of without stripping the testa， only peeling the episperm， and peeling endotesta and episperm were sterilized by 4% （V/V） blue moon and 0.1% HgCl2 for 7， 15， 23 respectively， and then conducted on its sowing test. [Result] The disinfection effect of 0.1% HgCl2 for 8 min was better than that of 4% （V/V） blue moon for 15 min， but they had no significant difference. The germination rate and growth potential of lemon of peeling endotesta and episperm were superior to those of only peeling the episperm. [Conclusion] HgCl2 dose not advocate using in test process because of its damage of sending canceration and mutagenicity， so the best treatment method of lemon seeds is 4% （V/V） blue moon for 15 min. The study provides a reference basis for tissue culture of lemon and breeding of no virus seedlings of orange.

Key words Lemon； Aseptic sowing； Sterile technique； testa

柠檬[Citrus limon （L.） Burm. f.]为常绿小乔木，原产东南亚，我国四川、广西、云南等地均有栽培。柠檬含有丰富的营养元素，是营养价值和药用价值极高的水果之一。柑橘苗木的育苗方法有嫁接、压条、扦插、实生、组织培养等，通过无菌播种人工培养，能够在短期内获得大量幼小植株，是现阶段经济有效的快速繁殖方法，也是工厂化育苗中茎尖微嫁接脱毒小苗的重要来源。无菌播种试验采用的消毒方法多为0.1%升汞消毒10 min，播种方法有撒播法、涂布法和稀释法。散播法的优点是简单易行，不易染菌，种子萌发快；涂布法的优点是种子在瓶内分布较均匀；稀释法的优点是种子经稀释后撒播，密度容易掌握，种子分布均匀，利用率高[1]。至今為止，与无菌播种相关的报道多为兰科植物和其他观赏类花卉，且多集中于对适合其生长的培养基、添加激素或其他天然提取物、培养时间等方面的研究，而关于柠檬无菌播种中最佳消毒时间、最佳消毒药剂、内外种皮剥离等影响其种子萌发的因素的研究少有报道[2-4]。为此，笔者研究柠檬种皮不同剥离程度（不剥种皮、只剥外种皮、剥除内外种皮）及不同消毒剂（4%（V/V）蓝月亮、0.1%升汞）消毒不同时间对柠檬种子萌发的影响，探讨种子萌发的适宜处理方法，以期为柠檬组织培养及柑橘无病毒苗木培育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 培养基及种子准备

配制MS培养基（培养基中加入琼脂8.0 g/L及蔗糖35.0 g/L），用1 mol/L NaOH或HCl溶液把pH调至5.8，加热溶解琼脂后趁热分装20～25 ml培养基于规格为30 mm×150 mm的平底试管中，高压蒸气灭菌锅121 ℃灭菌20 min，冷却，备用。

柠檬果实购自超市。从新鲜的果实中剥取种子。用1 mol/L NaOH溶液浸泡5 min，以软化种子表面的果胶，用清水反复冲洗直至果胶去除干净，备用。

1.2方法

1.2.1

不同消毒时间对柠檬无菌萌发的影响。在超净工作台上将剥去内外种皮的柠檬种子置于浓度4% （V/V）的蓝月亮溶液中分别浸泡7、15、23 min（记为处理A1、A2、A3），再用无菌水冲洗4～5次，每次1～2 min。然后播种于MS培养基上，播种时胚根朝下，种子的1/2插入培养基中，每试管3粒。每处理播种5管，3次重复。置于温度为26 ℃、空气相对湿度为80%的培养箱中，暗培养15 d，每隔3 d观察并统计一次种子的污染率。

1.2.2

不同消毒方法及种皮不同剥离程度对柠檬种子无菌萌发的影响。

设6个处理：B1和C1剥除外种皮及内种皮；B2和C2仅剥除外种皮；B3和C3不剥种皮。B1、B2和B3处理组用4%（V/V）蓝月亮消毒剂消毒15 min，C1、C2和C3处理组用0.1%升汞消毒剂消毒8 min。在超净工作台上将柠檬种子按照上述要求分类处理，然后按上述处理分别置于4% （V/V）的蓝月亮溶液中浸泡15 min和0.1%升汞消毒剂消毒8 min，再用无菌水冲洗种子4～5次，每次1～2 min。最后将种子播于MS培养基上，播种时胚根朝下，种子的1/2插入培养基中，每试管3粒。每种处理播种5管，3次重复。置于温度为26 ℃、空气相对湿度为80%的培养箱中，暗培养15 d，每隔3 d观察并统计一次种子污染率。

2 结果与分析

3结论与讨论

柠檬无菌播种研究是一项基础性工作，可以为柠檬的茎尖嫁接、育苗、大批量获得无菌黄化苗等研究的进一步开发利用提供理论依据。对于柠檬种子无菌播种，消毒剂的选取以及消毒时间的确定很重要。不同消毒时间对柠檬种子萌发、污染率及长势都有显著的影响。消毒时间过短过长都会影响种子的生长和发育。该试验中，4%（V/V）蓝月亮消毒15、23 min，在播种3 d后萌发率均达到了1000%；4%（V/V）蓝月亮消毒7 min，播种6 d后萌发率为93.3%。综合发芽势、芽长、根系长度等因素，4%（V/V）蓝月亮消毒15 min处理为最优处理。

最优处理，不剥种皮处理种子在MS培养基中极难发芽，用4%（V/V）蓝月亮消毒15 min和01%升汞消毒8 min，培养15 d的发芽率仅分别为21.4%和4.4%；而仅剥除外种皮处理发芽率居中。

因此，建议在研究和生产上进行柠檬无菌播种时剥除内外种皮。

在无菌条件下研究消毒剂及消毒剂消毒时间对柠檬萌发的影响还未见报道，该研究对快速获得无菌苗及组织培养材料有重要意义。该试验选取了常用的2种消毒剂0.1%升汞和4%（V/V）蓝月亮。其他消毒剂效果如何，消毒时间为多少最恰当，对结果有何影响，如何使种子萌发效率更高等，还有待于进一步研究。

参考文献

[1]

陈超，王桂兰，乔永旭，等. 蝴蝶兰无菌播种方法的比较研究[J].北方园艺，2006（1）：35-36.

[2] 邵和平，张宁宁，张琼，等. 卡特兰的无菌播种及组培快繁技术研究[J]. 江蘇农业科学，2013，41（5）： 50-52.

[3] 姚丽娟，陈义增，徐晓薇，等.大花蕙兰无菌播种技术试验[J].浙江林业科技， 2006，26（2）： 30-33.

[4] 王芬，徐步青，刘幸佳，等.春兰种子无菌播种萌发过程及其影响因素[J].浙江农林大学学报，2013，30（1）： 136-140.