“绿叶中色素的提取”实验改进

姚梁

笔者负责高中阶段的生物实验工作，在长期指导高中学生做“绿叶中色素的提取和分离”实验中，笔者发现即使是规范的实验操作后，仍有部分学生在最终的实验结果中只能看到三条色素带，另外一条很模糊甚至不能观察到。刨去实验操作的误差后，笔者苦思冥想，问题的症结在哪里？笔者把目光放到色素的提取量上，是否是色素提取量不够多？能否在高中提取方法的基础上进行改进或者改造，提高色素的提取量，以便能更快速、高效地提取出色素？

这项实验的关键是提高色素的提取率，提取色素的原理是色素会溶于有机溶剂中，普通高中课程生物实验中提取色素所用的有机溶剂是100%乙醇10ML。那么其他常见有机溶剂的提取效果是否更好？光下操作和黑暗下操作结果是否一致？重新梳理了下实验思路之后，笔者阅读和查看了大量的文献资料，发现提取色素常见的方法有：浸提法（soaking）和Arnon法。Arnon这个方法提出的时间较早，要点是将待测定的绿色材料用80%的丙酮溶液研磨并提取，经过过滤或者是离心后，再用分光光度法测量绿色材料的光密度值，但是也有缺点：提取麻烦，操作复杂，研磨和去残渣很耗时，这样就不可避免会暴露在阳光下，使得色素被分解，对操作的要求也比较高，造成误差。浸提法是由Shoaf和Hiscox等人提出来的，是最早想到用化学物质（二甲亚砜）浸提色素，这样避免了Arnon需要过滤离心等复杂操作，使得提取更简单准确，但是由于提取时间长，要看不同材料，以叶片变白为止，一般浸提时间至少需要0.5小时到2小时，有的甚至更长。温度还要维持在65°C，并且二甲亚砜有难闻的臭味且不好保存，成本高，所以该法经过改进，现在一般不用二甲亚砜，用其他的有机溶剂代替，比如陈福明、张宪政提出用混合液浸提法提取和测定色素的量，比如提取液单独用乙醇、丙酮、甲醇，后来还发展成有机溶剂进行混合配比，比如丙酮：乙醇=1：1，丙酮：乙醇：水=5：5：1，丙酮：甲醇=1：1等不同比例的混合液，尝试哪种混合比例为最佳。

我们都知道，光对色素来说具有破坏作用，高中实验课“绿叶中色素的提取”方法步骤中并没有要求避光操作，那是否有无光照是个无关变量，有没有影响色素的提取量？带着这些问题，笔者综合考虑上述因素，结合实验室实际情况，试着在高中实验方法的基础上进行改造，通过设置分组对照，对比不同有机溶剂及其混合液（由于实验室条件限制，选取丙酮：乙醇=1：1）和光照对色素提取的影响，用分光光度法定量测叶绿素含量，间接反映色素的量的方法进行实验。

一、实验部分

1.实验材料、主要仪器和试剂

新鲜菠菜叶，研钵，SP2000型可见分光光度计，SiO2，CaCO3，按体积比配制不同的提取液（乙醇10ML，丙酮10ml，甲醇10ML，均为分析纯）。

2.实验方法

（1）将试管均分成8组，每组分组编号，4组处于自然光下实验A1，A2，A3，A4，另4组处于昏暗处实验B1，B2，B3，B4。

（2）将菠菜叶洗净擦干，用剪刀在菠菜相同叶片位置取材（避开叶片茎秆），剪碎混匀，每组5g，放在各个研钵中。

（3）向8个研钵中放入少许等量SiO2，CaCO3，再分别加入提取液如下表：

■

（4）等速研磨3分钟。

（5）将每组研磨液迅速进行过滤，将滤液收集到试管中，塞紧试管口。

（6）用SP2000型分光光度计测叶绿素的含量，试测3次后，等待光吸收值稳定下来，再测量并计算叶绿素的含量，重复3次，求平均值，并在340～710光波段扫描吸收光谱并制图。叶绿素含量用Arnon法的公式：

叶绿素a=（12.7A664-2.69A646）×■

叶绿素b=（12.7A646-2.69A664）×■

叶绿素总量=（20.0A646+8.02A664）×■

或叶绿素总量=■×■

其中A664，A646，A651分别为对应波长的光密度值，V为绿叶材料提取液的体积，W为绿葉的鲜重。

3.结果分析

（1）叶绿素的吸收光谱比较

■

图1 8组不同叶绿素提取液吸收光谱图

（A1，A2，A3，A4画实线；B1，B2，B3，B4画虚线）

图1表明，8组实验吸收光谱曲线总体相似，波峰集中在430nm～445nm和660nm～670nm之间，波谷集中在554nm和606nm左右，说明不同提取液对菠菜吸收光谱的影响微弱。同时，不管是在光照下，还是在昏暗条件测量，8种叶绿素提取液的吸收光谱曲线也大体相似，说明是否有光对叶绿素吸收光谱的影响不大。

（2）不同提取液提取叶绿素的含量比较

表1 不同条件，不同提取液提取叶绿素的动态变化

■

分析表1结果，从数据的量来看，菠菜提取量的区分度差别不大，但是还是可以看到一些细微的区别和规律，具体体现在两点上：

一是总体观察表1，我们发现一个规律，不管是叶绿素a、叶绿素b，还是总叶绿素的量，An大于Bn，昏暗下提取的叶绿素的量比光下提取的量要更多些，这也就是说明：光对叶绿素的提取有破坏作用，在无光条件下提取量更多，所以，有条件的话最好在昏暗或者黑暗环境下进行操作，这样提取的色素量更多。

二是通过数据分析，对比不同提取液的提取效率，可以看出，乙醇：丙酮=1：1的提取液提取出来叶绿素量最多，效果最佳，课本中的例子乙醇提取效果次之，然后是丙酮，最后是甲醇。这说明：课本中的实验有改进的可能，有机溶剂乙醇不一定提取效率最高。当然，对于本次实验来讲，由于条件的限制，对于混合液的种类和比例，笔者的选择标准是高中阶段常见的3种有机溶剂及其比例，在这个效果下选出最佳。实际中，可能还有其他更优的配比还没找到，笔者试着给生物实验工作提供一个思路，希望能提高提取效率。

当然，通过对表格提取量的定量分析，对高中生物实验而言，这些提取量数据区分度也不算特别明显。我们在做生物实验的时候，除了要考虑提取量之外，还要考虑到操作的简易程度和各个学校的实际情况，尽量做到操作和效果上的平衡。

参考文献：

[1]陈福明，陈顺伟.混合液法测定叶绿素含量的研究[J].林业科技通讯，1989（5）：77-78.

[2]张宪政.植物叶绿素含量测定-丙酮乙醇混合液法[J].辽宁农业科学，1986（2）：4-8.

[3]苏正淑，张宪政.几种测定植物叶绿素含量的方法比较[J].植物生理学通讯，1989（5）：77-78.