墨西哥柏幼苗耐寒性研究

蔡祺　万福绪　韩李荃

摘要[目的]研究不同墨西哥柏幼苗在不同低温环境下各生理指标的变化。[方法]以10个不同种源的墨西哥柏离体叶片为材料进行低温胁迫试验，研究低温胁迫对墨西哥柏可溶性糖含量、可溶性淀粉含量、可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性的影响。[结果]墨西哥柏可溶性糖含量呈现一直上升的变化趋势，可溶性糖含量的增加有利于提高苗木的抗寒性；可溶性淀粉含量呈现“低-高-低”的变化趋势，可溶性淀粉含量的减少有利于提高苗木的抗寒性；可溶性蛋白含量呈现“低-高-低”的趋势，可溶性蛋白含量的增加有利于提高苗木的抗寒性；过氧化物酶活性大多呈现“低-高-低”的趋势，过氧化物酶活性的增加有利于提高苗木的抗寒性。[结论]不同低温处理下，墨西哥柏幼苗可溶性糖含量、可溶性淀粉含量、可溶性蛋白含量、过氧化物酶活性差异极显著。

关键词墨西哥柏；低温胁迫；生理指标；耐寒性

中圖分类号S791文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02651-04

基金项目国家“948”课题（2009417）。

作者简介蔡祺（1988-），男，内蒙古锡林浩特人，硕士研究生，研究方向： 林业生态工程。*通讯作者，教授，博士生导师，从事林业生态工程、水土保持研究。

墨西哥柏（Cupressus lustanica Mill），又名露丝柏，系柏木科柏木属常绿高大乔木。墨西哥柏原产中美洲的墨西哥高原及危地马拉南部地区，15°～27° N，垂直分布在海拔1 300～3 300 m。墨西哥柏大多生长在山坡及气候温暖湿润的河谷旁。原产地气候温暖湿润，属于亚热带温和至温暖气候；年平均气温10～17 ℃，每年干旱时间为2～3个月，全年降雨分布为均匀雨型，全年降雨量在1 000～1 500 mm，冬季有少量雨雪[1-3]。墨西哥柏是近年来石漠化治理的主要树种之一，该研究对墨西哥柏幼苗的耐寒性进行了分析，以期为筛选耐寒种苗提供基础资料。

1材料与方法

1.1试验材料2010年，从墨西哥（La presa、Pinal deamoles、La cienega、La cumbre del manzano、Dos aguas、Camino a la mesa、Ejido pio frio、Comunal san francisco、Tequesquinahuac、Ejido sierra de agua）成功引进10种不同地理种源墨西哥柏种子，种源依顺序分别用D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9、D10表示（表1）。

1.2试验处理试验材料为10种墨西哥柏2年生幼苗。每种源随机选取3棵树，3次重复。每次采样取生长健壮、长势整齐均匀的植株，剪取1 cm长的枝条。将供试苗木先用自来水冲洗，再用去离子水反复冲洗干净，用滤纸吸干苗木外表水分。将每个材料叶片分成4份，放入密封的塑料袋内。将分装好的叶片放入预设好温度的冰箱内，温度梯度分别为0、-4、-8、-12 ℃。将需采取人工低温处理的试验材料先在2 ℃的冰箱内预冷2 h，然后模拟自然降温过程，从0 ℃开始按照4 ℃/h的降温速度逐步进行降温。到达设定温度后停留24 h，将材料取出后置于2 ℃冰箱中解冻2 h后再进行研究。

1.3指标测定方法测定每个温度梯度下样品的可溶性糖含量、可溶性淀粉含量、可溶性蛋白含量、过氧化物酶（POD）活性。可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[4]；可溶性淀粉含量测定采用蒽酮比色法[4]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250法[5]；POD活性测定采用愈创木酚比色法[6]。

2结果与分析

2.1低温胁迫对10种墨西哥柏可溶性糖含量的影响试验表明，在低温胁迫下，随着低温胁迫伤害的不断加深，10种墨西哥柏的叶片可溶性糖含量整体呈不同程度的上升趋势，每个种源上升的幅度不同，个别种源随温度降低出现了先上升后下降的趋势（图1）。在0 ℃胁迫下，墨西哥柏可溶性糖含量最低，其中D2种源含量最低为15.272 mg/g，D4、D5、D6、D9、D10种源的可溶性糖含量较高，D4种源可溶性糖含量是D2种源的1.2倍。0～-4 ℃各种源叶片可溶性糖含量有小幅度的上升，D5种源在-4 ℃时可溶性糖含量达到20287 mg/g，是D8种源的1.26倍，D9种源增长的最少。-4～-8 ℃，墨西哥柏叶片可溶性糖含量上升幅度加大，说明植物已经逐渐适应低温环境，对寒冷产生了抵御。相对于0 ℃时的可溶性糖含量，D5种源涨幅最大，约为0 ℃时的1.35倍。在-8～-12 ℃，墨西哥柏可溶性糖含量增长减缓，D5种源叶片可溶性糖含量出现小幅回落。方差分析结果表明，Sig=0.000<0.01，说明不同温度处理间可溶性糖含量差异极显著；Sig=0.000<0.01，说明种源间的可溶性糖含量差异极显著；Sig=0.075>0.05，说明各种源与温度交互下墨西哥柏叶片可溶性糖含量差异不显著。各种源墨西哥柏叶片的可溶性糖含量在不同低温胁迫下平均值大小顺序为：-12 ℃、-8 ℃、-4 ℃、0 ℃。D9种源叶片可溶性糖含量最大，D8种源最小。

2.2低温胁迫对10种墨西哥柏可溶性淀粉含量的影响试验表明，10种不同种源地的墨西哥柏的可溶性淀粉含量随温度的降低，大多表现为先下降再上升再下降的趋势，个别种源呈现出下降再上升或者一直下降趋势，但各种源在不同温度胁迫下，下降或者上升的幅度并不相同（图2）。在0 ℃时，不同种源叶片可溶性淀粉的含量有所差别，其中D5、D6和D7种源的叶片可溶性淀粉含量较高，D3、D8和D9种源含量较低，含量最高的D7种源是含量最低的D3种源的2.4倍。在0～-4 ℃，各种源叶片的可溶性淀粉含量快速下降，且降幅较大，其中D6种源下降最快，降幅最大，达到179%，D7、D8、D9种源下降幅度与其他种源相比较小，在-4 ℃时，D3种源叶片可溶性淀粉含量最少，约为4.491 mg/g。在-4～-8 ℃，部分种源叶片可溶性淀粉含量有小幅度的上升，D2、D3种源叶片可溶性淀粉上升幅度较大，而D1、D6、D7和D8种源的可溶性淀粉含量继续下降，但下降幅度都不大，可能因为这些种源对低温的反应速度与其他种源不同。在-8～-12 ℃，大部分种源叶片的可溶性淀粉含量继续下降，但下降幅度都不大。方差分析结果表明，Sig=0.000<001，说明不同温度处理间可溶性淀粉含量差异极显著；Sig=0.056>0.05，说明种源间的可溶性淀粉含量差异不显著；Sig=0018<0.05，说明各种源与温度交互下墨西哥柏叶片可溶性淀粉含量差异显著。各种源墨西哥柏叶片的可溶性淀粉含量在不同低温胁迫下平均值大小顺序为：0 ℃、-8 ℃、-12 ℃、-4 ℃。D5种源叶片可溶性淀粉含量最大，D10种源最小。

图2低温处理对10种墨西哥柏可溶性淀粉含量的影响2.3低温胁迫对10种墨西哥柏可溶性蛋白含量的影响试验表明，随着人工低温胁迫的加深，10种墨西哥柏叶片内可溶性蛋白随温度降低呈现“低-高-低”的趋势，并在-8 ℃处达到峰值，在-8～-12 ℃之间迅速下降，降幅较大（图3）。在0 ℃处，D1～D10这10种墨西哥柏叶片的可溶性蛋白的含量在1.016～1.443 mg/g之间，其中D5种源的可溶性蛋白含量最高，D10种源的可溶性蛋白含量最低。在0～-4 ℃间，不同种源墨西哥柏叶片的可溶性蛋白含量的涨幅都不大，其中D5和D7种源叶片的可溶性蛋白含量基本不变。在-4～-8 ℃处，不同种源的墨西哥柏叶片可溶性蛋白含量仍呈小幅度增长趋势，D4种源增幅最小，只有9.9%。-8～-12 ℃，D1～D10 10种墨西哥柏叶片的可溶性蛋白含量快速下降，降幅分别为80.88%、53.66%、25.80%、6524%、19.76%、4052%、3370%、60.93%、80.48%和7736%。方差分析结果表明，Sig=0.000<0.01，说明不同温度处理间可溶性蛋白含量差异极显著；Sig=0.000<0.01，说明种源间的可溶性蛋白含量差异极显著；Sig=0.071>005，说明各种源与温度交互下墨西哥柏叶片可溶性蛋白含量差异不显著。各种源墨西哥柏叶片的可溶性蛋白含量在不同低温胁迫下平均值大小顺序为：-8 ℃、-4 ℃、0 ℃、-12 ℃。D5种源叶片可溶性蛋白含量最大，D1种源最小。

2.4低温胁迫对10种墨西哥柏过氧化物酶（POD）活性的影响试验表明，10种墨西哥柏在低温胁迫不断加深的过程中，叶片的过氧化物酶活性整体呈现“低-高-低”的趋势，并在-8 ℃处出现峰值（图4）。在0～-4 ℃整体呈现出随温度的降低过氧化物酶活性增高，个别种源继续降低，在-4～-8 ℃，各种源叶片过氧化物酶活性整体呈现出随温度的降低而增高的趋势，在-8～-12 ℃呈现出随温度继续降低各种源叶片过氧化物酶活性又急剧降低的变化规律。在0 ℃，D9种源叶片的过氧化物酶活性最低，约为93 U/（min·g），D2的过氧化物酶活性最高，约为214 U/（min·g）。0～-4 ℃间，各种源过氧化物酶活性大多呈上涨趋势，D1、D2、D7和D10种源表现为不同程度的下降，其中D2、D7种源叶片过氧化物酶活性下降较快，下降幅度约为23.24%、59.02%，D1、D10变化幅度极小。在-4～-8 ℃，除D4、D9种源叶片过氧化物酶活性变化不大，其他种源叶片均增长幅度较大，特别是D1、D6和D8种源，其叶片过氧化物酶活性急剧增长，增幅分别约为126.61%、141.75%和94.72%。在-8～-12 ℃，各种源墨西哥柏叶片过氧化物酶活性急剧下降，其中D1、D2、D3、D6、D7和D8种源降幅较大，分别为106.19%、108.14%、137.63%、104.55%、112.68%和119.55%。方差分析结果表明，Sig=0.000<0.01，说明不同温度处理间POD活性差异极显著；Sig=0.001<0.01，说明种源间的POD活性差异极显著；Sig=0.029<0.05，表明各种源与温度交互下墨西哥柏叶片POD活性差异显著。各种源墨西哥柏叶片的过氧化物酶活性在不同低温胁迫下平均值大小顺序为：-8 ℃、-4 ℃、-12 ℃、0 ℃。D5种源叶片POD活性最大，D1种源最小。

3结论与讨论

3.1可溶性糖与抗寒性低温胁迫初期，可溶性糖的积累是一个普遍现象。有研究发现：低温胁迫下假俭草体内可溶性糖含量增多，其耐寒性也增强。可溶性糖能够提高细胞液浓度，降低冰点，提高细胞内束缚水含量，保护细胞质体，增强细胞液的流动性，增强原生质粘性，细胞耐结冰能力、防脱水能力、耐冻性均变强[7]。植物的可溶性糖含量常被作为衡量植物抗寒性的重要指标，它是植物在抗寒锻炼中，调节细胞质浓度的重要物质，具有低温保护、防止蛋白质变性的作用，它的含量多少与植物耐寒性紧密相关。可溶性糖含量越高，植物细胞液浓度也越高，植物抵御寒冷的能力也越强[8]。

大量研究表明，随温度的降低，植物可溶性糖含量升高，两者呈负相关，该试验也得到了相似的结论。在该试验中，10种墨西哥柏叶片可溶性糖含量在温度逐渐降低的过程中，表现出逐渐增多的变化趋势。在低温胁迫初期，叶片可溶性糖含量增多，可能是因为温度降低，植物的呼吸速率减慢，植物合成的可溶糖没有被呼吸作用大量消耗而有所积累；也可能因为低温导致植物淀粉水解酶大量合成，促使叶片内淀粉大量水解。到了低温胁迫中期，植物可溶性糖含量急剧增加，可能因为植物已经对寒冷环境产生了防御，通过增加可溶性糖含量来提高细胞液浓度，保护细胞质，缓冲植物细胞质过度脱水，防止植物蛋白质失活，增强耐寒能力。在低温胁迫后期植物叶片的可溶性糖含量增幅减慢，可能是因为低温胁迫加剧，植物为了大量产热而使呼吸作用增强，消耗了大量可溶性糖，因此出现可溶性糖增长缓慢的现象。该试验发现，D4、D5、D9种源的可溶性糖含量于其他种源相比较高，可能是这3种墨西哥柏抗寒性较高的原因。

3.2可溶性淀粉与抗寒性大量研究证明，植物在不同低温胁迫下，可溶性淀粉含量与植物抗寒性密切相关。田景花等[9]对黄瓜幼叶的低温冷稳定性研究中表明，常温下黄瓜幼叶淀粉粒大量积累，但是低温下幼叶淀粉粒大量分解或消失。植物在遭遇寒冷胁迫时，可溶性淀粉含量呈下降趋势[10]。低温可以诱导淀粉水解酶的活性增强， 加速淀粉分解[11-12]。

在该试验中，通过对10种墨西哥柏可溶性淀粉含量进行测定，发现各种源墨西哥柏叶片可溶性淀粉含量基本呈现“低-高-低”的变化趋势。在0～-4 ℃间，各种源墨西哥柏叶片可溶性淀粉含量急剧下降，低温诱导淀粉水解酶活性增强，可溶性淀粉大量水解，产生可溶性糖，增强植物细胞渗透性。-4～-8 ℃间，部分种源可溶性淀粉含量上升，可能是因為可溶性糖由于光合作用和淀粉水解的大量增加，高浓度的可溶性糖促进了可溶性淀粉的合成，也可能是低温使植物呼吸速率降低，植物呼吸消耗的能源变少，淀粉分解量也变少。低温胁迫后期，由于低温胁迫加深，需要更多的可溶性糖来提供植物所需的能量，提高植物产热，就促使植物可溶性淀粉进一步分解成可溶性糖，导致植物叶片可溶性淀粉含量下降。

3.3可溶性蛋白与抗寒性可溶性蛋白质具有渗透调节、保水及降低冰点的作用，部分可溶性蛋白还是功能蛋白酶，低温能抑制蛋白质的合成，从而会降低植物的抗寒性[13]。但是在低温胁迫下植物的可溶性蛋白含量与温度的关系目前还没有得到统一。大多学者认为低温会导致植物可溶性蛋白含量增加，但也有学者研究发现部分植物在低温环境下可溶性蛋白含量减少，可能是植物的含水量、成熟期、营养情况不同而导致。

该试验对10种墨西哥柏叶片进行不同温度梯度的人工低温处理，通过测定其叶片的可溶性蛋白含量，发现各种源墨西哥柏叶片可溶性蛋白含量呈现“低-高-低”的变化趋势。在低温胁迫初期和中期，植物的可溶性蛋白含量一直增加，说明各种源墨西哥柏在逐渐适应低温环境时，对低温胁迫产生抵抗，通过增加叶片可溶性蛋白的含量来提高植物细胞的渗透性，防止植物脱水死亡，增加其抵御寒冷的能力，也可能因为这些蛋白是一些功能酶，它们有自己的特殊功能——增强植物的新陈代谢能力，它们的增加可以使植物在寒冷环境下快速代谢，产生能量，抵抗低温带来的不良反应。在低温胁迫后期，各种源墨西哥柏叶片的可溶性蛋白含量迅速降低，可能是植物的一些蛋白质分解成氨基酸，也可能是一些合成蛋白质的酶类在低温环境下活性降低，合成效果不佳。

3.4过氧化物酶与抗寒性过氧化物酶是植物体内普遍存在的一种保护酶，它能够促进超氧自由基形成的H2O2降解，还可以促进分解叶绿素和生长素。当逆境胁迫时，植物体内可动员保护系统中的酶促系统和非酶促系统抵御和清除活性氧，阻止膜脂过氧化，维持膜系统的稳定性。目前，过氧化物酶与植物抗寒性的关系在多数的研究中已被证实。张玮等[14]对麻竹的抗寒性试验证明：在低温胁迫过程中，过氧化物酶活性明显提高，而且一直维持在高于对照的水平上。

在该试验中，10种源墨西哥柏叶片在人工低温胁迫条件下，过氧化物酶活性随着温度的降低大多数呈现“先上升后下降”的趋势。D2和D7种源墨西哥柏叶片的过氧化物酶活性在0～-4 ℃间下降，可能是因为该种源墨西哥柏对寒冷的敏感性不够强，对低温反应较慢，还没有产生对寒冷的抵御，在低温下酶活性降低；其他种源过氧化物酶活性增加，可能是因为对寒冷环境产生了抵御能力，通过增加过氧化物酶活性，增强对细胞内自由基的清除能力，减少活性氧，阻止膜脂过氧化，从而保护细胞。在低温胁迫后期，各种源叶片的过氧化物酶活性大幅度降低，可能是因为随着低温胁迫的加剧，植物体内的自由基大量积累，导致植物细胞膜脂过氧化严重，使墨西哥柏细胞膜系统遭受严重损坏，甚至造成细胞死亡，植物功能产生障碍。整个过程中，D5、D6和D10种源叶片过氧化物酶活性一直维持着较高的水平，说明这些种源墨西哥柏在低温胁迫过程中，在过氧化物酶活性这一生理指标上表现出较强的抗寒性。

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