妊娠期糖尿病胎鼠心脏发育过程中锌指转录因子GATA结合蛋白4 的变化规律

黎旻

近几年的流行病学调查结果显示，妊娠期糖尿病的发病率呈现逐年升高的趋势，且在妊娠期出现糖尿病会对胎儿的发育健康造成严重的影响，比较常见的为巨大儿、先天畸形甚至死胎[1]。有学者指出，妊娠期糖尿病可导致胎儿心脏畸形，从而严重影响胎儿的生长发育。研究显示[2]，锌指转录因子GATA结合蛋白4 同心脏发育之间存在明显的相关性，为心脏发育过程中一个相对敏感的调控因子[3-4]。本研究对妊娠期糖尿病胎鼠心脏发育过程中锌指转录因子GATA结合蛋白4 的变化规律进行分析探讨，对妊娠期糖尿病SD鼠和妊娠非糖尿病鼠进行心脏GATA-4 mRNA水平检测，并对比分析检测结果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 研究装研究对象为F级健康成年SD雌鼠50只、体质量(221±19)g，将其随机分成对照组与观察组，质量198～236 g，平均为（219±22）g，所有雌鼠均购于广东省医学实验动物中心，实验动物许可证号为SCXK(粤)2008—0002，粤监证字为2008 A 020。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 将以上两组研究鼠进行人工受孕后，观察组造模致妊娠糖尿病，并在受孕后12、15、19 d后行心脏解剖，对GATA-4 mRNA水平进行检测，而后对比分析两组检测结果。

1.2.2 实验方法 所需试剂包括有：浓度为2%的链脲佐菌素、GATA-4 抗体、Trizol提取液、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒、HRP标记的CAPDH、蛋白样品试剂盒。首先将上述50只SD鼠进行人工受孕，观察组经腹腔注射浓度为2%的链脲佐菌素，造模致妊娠期糖尿病，而对照组则给予腹腔注射相同剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液[5-7]。给药后3 d内对两组研究鼠实施监测血糖，并在受孕后的12、15 d 以及19 d后解剖取胎鼠心脏组织，经HE染色后对心脏发育情况进行观察，并作对比。

取新鲜的胎鼠心脏组织，给予500 μlRIPA裂解液后，在匀浆器上进行反复碾碎，并经离心处理提取总蛋白，依照试剂盒说明书对总蛋白展开初步定量，而后取含有蛋白的10 μl溶液上样，加入样品处理液后，煮沸，经SDS-PAGE电泳，持续时间为2 h，而后转移至PVDF膜，在室温下经浓度为5%的脱脂奶粉进行1 h的封闭，洗膜后加Ⅰ抗后在4℃条件下孵育过夜，经TBST洗膜3 次，而后加入Ⅱ抗，室温下孵育1 h后经TBST洗膜3 次，将化学荧光发光底物涂抹在膜表面，持续5 min后将膜表面的残夜去除，放置在曝光盒中进行曝光、显影以及定影[8]。对所得相关资料数据进行处理，并展开统计分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0 统计学软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组与对照组胎鼠心脏畸形发生率比较 在受孕后19 d解剖的10 只鼠中，观察组中发生胎鼠心脏畸形者4 只（40.0%），对照组发生胎鼠心脏畸形者1 例（10.0%），观察组畸形发生率较对照组高（P<0.05）。

2.2 观察组与对照组GATA-4 mRNA水平比较 在受孕后15 d后胎鼠心脏组织中GATA-4 mRNA水平最高，均高于12、19 d时检测结果（P<0.05），且观察组各时间段的检测结果均较对照组发生明显降低（P<0.05）。见表1。

表1 观察组与对照组GATA-4 mRNA水平比较（±s）

表1 观察组与对照组GATA-4 mRNA水平比较（±s）

注：与本组受孕后15 d比较，aP<0.05

组别 受孕12 d 受孕15 d 受孕19 d对照组 1.16±0.03 a 1.55±0.12 0.91±0.02 a观察组 0.82±0.01 1.21±0.08 0.70±0.03 t值 13.2212 13.9824 13.7624 P值 0.0187 0.0136 0.0158

3 讨论

妊娠糖尿病是指在妊娠后首次出现或者发病的糖尿病，经流行病学调查结果显示，在糖尿病孕妇中有80%以上者属于妊娠糖尿病。有研究证实，妊娠糖尿病会对母亲健康以及胎儿的发育产生十分严重的影响，会造成胚胎期心血管畸形[9]。目前关于妊娠糖尿病的发病机制还不是十分清楚。有学者指出[10]，高血糖会利用诸多的生物化学机制的诱导而对人体造成损害，其中以高血糖诱发线粒体活性氧簇最为显著，并且，妊娠糖尿病的发生还会受遗传、免疫等因素的影响。

流行病学调查结果显示[11]，妊娠期糖尿病会造成吸收胎、死胎、畸形胎、巨大儿等诸多的发育异常。在造成心脏畸形中，会导致心室流出道梗阻、室间隔缺损、室间隔裂、心腔扩大、肌壁肥厚等[12]。本研究中，在受孕后15 d后胎鼠心脏组织中GATA-4 mRNA水平最高，均高于12、19 d时检测结果（P<0.05），且观察组各时间段的检测结果均较对照组发生明显降低（P<0.05），可见，本研究在采用2%STZ腹腔注射已受孕的SD雌鼠成功建立GDM模型鼠基础上，观察组中吸收胎、死胎、畸心胎、巨大胎儿等发育异常例数较对照组明显提升；且观察组胎鼠心脏发育异常，即包括心室流出道梗阻、室间隔缺损及室间隔裂、肌壁肥厚、心腔扩大等发生率均较对照组明显增加，这与相关文献报道[13]的妊娠糖尿病确实会诱发心脏发育异常结果一致。

研究证实，GATA-4 参与了整个心脏发育过程中，为十分重要的一种转录因子，使心脏正常发育所必需的一种物质，会对诸多的心脏转录基因表达进行有效的调控，同时会利用锌指结果同其它的心脏转录因子发生相互作用。GATA-4 主要[14]在胚胎期的心脏、肝脏、性腺以及内胚层表达，同其他的因子发生协同作用，对心原细胞的特异性分化等进行控制，目前关于GATA-4对妊娠糖尿病胎鼠心脏发育的影响还不是十分清楚，曾有相关文献指出其为导致胎鼠心脏发育异常的主要因素[15]。本研究对50 只人工受精的雌鼠进行GATA-4 mRNA水平监测，结果发现，妊娠糖尿病的观察组中胎鼠心脏畸形的发生率较对照组高，且GATA-4 mRNA水平较对照组发生明显的降低，由此可知，GATA-4 mRNA水平低表达会对胎鼠心脏发育产生一定程度的影响。

曾有学者经实验证实[15]，在高血糖的环境下，大鼠的心肌细胞中GATA-4 蛋白含量会发生明显降低，并且经STZ所诱导的糖尿病模型鼠心脏组织中GATA-4 水平也明显降低，GATA-4过度表达也可以对高血糖所引起的心肌细胞死亡等作用进行抑制，由此可以证实GATA-4 蛋白降解的增加为诱发高血糖致心脏畸形的一个主要因素。

综上所述，作为多种心脏基因表达的调控因子，GATA-4 为妊娠糖尿病致心脏发育异常的一个重要机制，这一结果对于今后的妊娠糖尿病胎儿发育研究具有重要的临床意义。

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