鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗的效果评价研究

孟 超，李宝臣，叶曼曼，周 飞，李肖梁，方维焕

(1.浙江大学动物预防医学研究所，浙江杭州310058;2.浙江诺倍威生物技术有限公司;3.宁波大学)

鸭传染性浆膜炎，又称鸭疫里默氏杆菌病，是由鸭疫里默氏杆菌(RA)引起，危害养鸭业的主要疫病之一。1932年，美国学者Hendrickson 和Hilbert首次报道该病［1］，1936年，美国伊利诺斯州的一个商品鸭场发生该病，曾被称为“鸭败血症”，Dougherty(1955)［2］等，经全面病理学研究后，将该病命名为“传染性浆膜炎”。Leibovitz(1972)［3］提议使用“鸭疫里默氏杆菌感染”名称。

我国自1982年郭玉璞(1982)［4］等从北京郊区鸭场首次分离到鸭疫里默氏杆菌以来，所有养鸭地区几乎均有该病的发生，鸭、鹅及火鸡等多种禽类易感，是一种接触性传染病，多呈急性或慢性败血症过程，以纤维素性肝周炎、心包炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎为主要特征，传播速度快，死亡率较高，对抗生素的耐药性不断增加，疫苗免疫是控制该病的有效方法之一。

1 材料与方法

1.1 试验材料 鸭疫里氏杆菌血清1 型SG4 株和血清2 型ZZY7 株由中国农业大学提供;鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗(1 型SG4 株+2 型ZZY7 株)由浙江某生物技术有限公司生产提供，批次分别为201305、201306 和201307。

试验动物为3日龄雏鸭，由绍兴某种鸭场提供，品种为绍兴麻鸭。

试验在杭州某生物技术有限公司进行。

1.2 安全性检验 选取3日龄玻板凝集试验为RA血清抗体阴性的雏鸭，免疫剂量为每羽0.25 mL 和0.5 mL，每一剂量组各免疫雏鸭30 羽，免疫途径为颈部皮下注射。30 羽作为空白对照，相同条件下饲养观察35 d。

每日观察供试鸭精神、采食、粪便及临床变化;每周分别扑杀5 羽，观察接种部位的吸收情况及其他异常状况。

1.3 攻毒效果试验 主要通过免疫攻毒方法进行，每批次疫苗选取3日龄玻板凝集试验为RA 血清抗体阴性的雏鸭50 羽，随机分为5 组，每组10 羽。其中两组为免疫组，免疫剂量为0.25 mL/羽;另两组为未免疫攻毒对照组，第五组为不免疫和攻毒对照组。

免疫途径为颈部皮下注射，动物隔离器内饲养观察21 d。免疫组与未免疫攻毒组分别使用血清1型SG4 株和血清2 型ZZY7 株强毒进行攻毒，腿部肌内注射1.0 ×1010CFU 的鸭疫里氏杆菌SG4 或1.0 ×105CFU 鸭疫里氏杆菌ZZY7 株菌液。攻毒后7 d 内观察发病和死亡情况。

1.4 微量凝集抗体检测试验 将免疫后21 d 的供试鸭通过翅静脉采血至1.5 mL 离心管内，37℃温箱中静置1 h，然后8000 rpm 离心5 min，吸出析出血清，备用。将培养的鸭疫里默氏杆菌SG4 株和ZZY7 株菌液计数，然后用0.3%甲醛溶液灭活，再将灭活后的菌液5000 rpm 离心30 min。用生理盐水离心洗涤3 次，最后一次菌悬液用生理盐水调节至1.0 ×109CFU/mL，作为微量凝集抗体检测试验用抗原。

试验步骤:将96 孔凝集板中加入50 μL 生理盐水，再将第一孔加入50 μL 待检血清，然后进行倍比稀释，直至212 次方。

每个血清样品两次稀释，分别加入SG4 株和ZZY7 株抗原50 μL，混匀后密封，室温条件静置24 h 后观察沉淀状况。

1.5 无菌检验 根据2010年版《中华人民共和国兽药典》第三部所提供的方法进行检验。

将样品量1 mL 接种含有50 mL 硫乙醇酸盐培养基中，37℃培养72 h。然后将培养物移植至TG小管和GA 斜面(0.2 mL/支)，1 支在37℃培养，1支在25℃培养，另取1 支GP 0.2 mL/支，在25℃培养，观察7 d，应无菌生长。

1.6 剂型和黏度 剂型检查主要确定剂型是油包水(O/W)或水包油(W/O)。方法是将疫苗乳剂先滴1 滴在水中，然后滴第2 滴，如果未出现扩散，其剂型则为油包水剂型，若第2 滴出现扩散则其剂型为水包油。

黏度检测主要通过黏度计测定，其原理是将转子浸入供试样品溶液中，使转子以一定的角速度旋转，通过测量作用在转子上的扭力矩，然后换算成黏度值。

2 结果与分析

2.1 安全性检验 详见表1。

表1 三批鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗安全检验结果

由表1可见，第5 周时，疫苗已基本吸收完全，仅残留少量黄色干酪样物。

2.2 体重变化 详见表2。

表2 三批鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗安全检验过程中的供试鸭体重变化

由表2可见，三批次疫苗免疫组鸭体重与未免疫组鸭体重未见明显差异。

2.3 攻毒效果试验 详见表3。

表3 三批鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗效力

由表3可见，血清1 型SG4 株为1 ×1010CFU/羽(复核后剂量为0.98 ×1010CFU/羽)，血清2 型ZZY7 株为1 ×105CFU/羽(复核后剂量为1.3 ×105CFU/羽)，腿部肌内注射后观察7 d，未免疫组鸭在攻毒后的死亡率达90%以上，免疫组所有供试鸭均未见死亡。

2.4 微量凝集抗体检测结果 详见表4。

表4 3 批次鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗免疫后凝集抗体检测

由表4可见，免疫后21 d 血清凝集抗体检测结果表明，SG4 株抗体效价均在7.7－8.5 log2 之间，显著高于ZZY7 株抗体效价(3.0－3.4 log2)。三个批次疫苗间的抗体效价基本稳定。

2.5 无菌检验 将三批疫苗进行无菌检验，菌检结果均为阴性。

2.6 剂型、黏度和稳定性检验 将疫苗1 滴滴于水中，然后滴第2 滴，呈圆形，均未出现扩散，说明该疫苗剂型属油包水剂型(W/O)。

经黏度计检测三批疫苗的黏度值分别为48.5 cP、55.0 cP、53.5 cP。3000 rpm 离心15 min 后，剂型稳定(不破乳)。

3 小结与讨论

本试验经过全项检验，证明三个批次疫苗抗体效价基本稳定，在使用安全性剂量免疫时，对3日龄雏鸭未见任何明显影响，35 d 左右即可完全吸收，且经过免疫后28 d 观察，雏鸭体重增长情况处于正常水平。

马逊(2010)［5］和王小兰(2012)［6］等均将RA疫苗通过攻毒保护试验得到良好保护，说明RA 有着良好的免疫原性。

本次攻毒效果试验结果表明，鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗能够较好保护鸭疫里默氏杆菌血清1型和血清2 型的强毒攻击，抗体效价基本稳定。无菌检验、黏度检测、稳定性和剂型检测都处于良好水平。

综合上述结果，表明浙江某生物技术有限公司试制的鸭疫里默氏杆菌二价灭活疫苗安全、稳定、有效，具有良好的推广应用价值。

［1］郑龙光.鸭传染性浆膜炎的研究进展［J］.兽医导刊，2012，6:57－58.

［2］Dougherty E，Saunders LZ，Parsons EH.The pathology of infectious serositis of ducks［J］.American Journal of Pathology，1955，31:475－487.

［3］Lebovitz L.A survey of the so-called ‘anatipestifer syndrome’［J］.Avian Diseases，1972，16:836－851.

［4］郭玉璞，陈德威，范国雄，等.北京鸭传染性浆膜炎的调查研究［J］.畜牧兽医学报，1982，13(2):106－112.

［5］马逊.鸭传染性浆膜炎油乳剂灭活疫苗与不同佐剂二联灭活疫苗的免疫原性比较研究［D］.成都:四川农业大学，2010:18－23.

［6］王小兰.鸭疫里默氏杆菌多价油乳剂灭活疫苗的研制［D］.上海:上海兽医研所，2012:30－44.