不同血清浓度对金华猪耳缘组织成纤维细胞体外生长的影响研究

屠平光，项 云，章啸君，楼芳芳

(金华市农业科学研究院，浙江金华321000)

成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，特征为生长较快、细胞和细胞核较大，显微镜下可观察到清晰轮廓，呈典型梭形、星形或多边形，细胞核为卵圆形［1］。目前，成纤维细胞被广泛用于生产体细胞克隆猪［2－3］、转基因猪及制作猪诱导多功能性干细胞［4－5］。

金华猪是我国优良地方猪种，体型中等偏小，具有基因较纯、遗传性稳定、表型均一和遗传背景清楚等优点，是目前生物医学、异种器官移植、人类疾病模型建立等领域研究的理想材料。由于动物遗传资源能够以细胞系的方式保存［5］，因此优化培养体系，建立稳定的金华猪耳缘组织成纤维细胞系，可以使金华猪这一宝贵的遗传资源在细胞学水平上得到长期保存，为体细胞核移植、转基因和异种器官移植等相关研究提供技术基础。

本试验采用组织块贴壁法培养金华猪耳缘组织成纤维细胞，并在不同血清浓度下，观察其对金华猪耳缘组织成纤维细胞体外生长的影响，为进一步改进其培养技术、筛选更好的细胞培养体系提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 培养基(DMEM)，胎牛血清(FBS)，青霉素、链霉素混合液(含青霉素10000 u/mL、链霉素10 μg/mL);0.25%胰蛋白酶溶液，PBS液均为Hyclone 公司产品。

倒置显微镜OLYMPASCKX41;二氧化碳培箱Thermo311 型;酶标仪伯乐680 型。

1.2 培养方法

1.2.1 取材 采集金华猪耳缘组织浸入PBS 液中，置实验室无菌操作台，用75%酒精浸泡45 s 后，放入含双抗的PBS 液中漂洗数次，以确保组织无菌。

1.2.2 组织块贴壁培养法 将组织块置于培养皿中，加入完全培养液，用眼科剪刀反复剪切组织块，剪成1 mm3大小的小块。用眼科镊子将组织小块在无菌60 mm 培养皿中均匀摆放，间距约0.3 cm。放置后，轻轻翻转培养皿，倒置放入37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。4 h 后，待培养皿中组织半干贴附后，慢慢翻转平放培养皿，轻轻加入含5%、10%、15%血清的培养基中，注意防止组织块漂浮，标记后放入CO2培养箱中继续培养。2 d 后取出，置于倒置显微镜下观察组织块迁移率，同时进行换液［6］。

1.2.3 传代培养 待原代细胞汇合成片，约占培养皿底面积80%～90%时，进行传代培养。传代前24 h 内更换新鲜培养液。取出培养皿后，置于无菌操作台内，倒弃原培养液，加入2 mL PBS 液清洗细胞2 次后，在培养皿中加入消化液0.5 mL，轻轻振荡，倒置显微镜下观察，待大部分细胞变圆、漂浮后，在培养皿中加入4 mL 培养液终止消化，轻轻吹打，使细胞分散。以1000 r/min、离心5 min，弃上清液，再加入2 mL 培养液吹打重悬浮细胞，再次以1000 r/min 、离心5 min，弃上清液，以2 mL 培养液吹打重悬浮细胞，使用血球计数板和0.4%台盼蓝染液进行活细胞计数，使细胞密度为2 ×105个/mL。随后，接入新培养皿中，置37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中继续培养。

1.3 耳缘成纤维细胞纯化 成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感度不同，成纤维细胞对消化液较上皮细胞敏感，合适时间可以使成纤维细胞脱壁，而上皮细胞则仍然贴在瓶壁上。

经过2～3 次消化传代后即可得到纯化的成纤维细胞。

1.4 MTT 法检测血清浓度对细胞数量的影响 用传代培养的第3 代细胞胰酶消化，分别用含不同浓度的血清配成单个细胞悬液，以每孔1 ×104个/mL细胞接种于96 孔培养板中，每组10 孔，培养2 d后，取出培养板进行检测。

每孔加入MTT 溶液(5 g/L)20 μL，继续培养4 h 后终止培养，轻轻吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择波长490 nm，用酶标仪测定各孔光吸收值(A 值)。

1.5 数据处理 对不同浓度血清培养的金华猪耳缘组织成纤维细胞的MTT 结果，采用方差分析。

不同组别数据间比较采用t 检验。

2 结果与分析

2.1 倒置显微镜观察结果 采用组织块贴壁培养法血清浓度为10%与15%时，培养4 d 后即有细胞沿组织块周围生长出现(图1－1)，培养8 d 后成纤维细胞呈优势生长状态(图1－2)，培养13 d 左右即可长满培养瓶底(图1－3)。血清浓度为5%时，4 d 后未见细胞沿组织块周围出现，10 d 后才见少量细胞沿组织块周围出现，21 d 左右才铺满培养瓶底。

细胞经2～3 次消化传代后即可得到纯化的成纤维细胞，细胞呈梭形、三角形，为典型的成纤维形态，胞质近中央处有椭圆形胞核。成群细胞呈束状、漩涡状(图1－4)。

图1 组织块贴壁培养法成纤维细胞生长态势

2.2 MTT 检测结果 金华猪耳缘组织成纤维细胞在10%、15%血清培养基中，细胞生长旺盛，活力较强，差异不显著(P ＞0.05);在5%血清培养基中，细胞生长缓慢，细胞活力明显低于10%与15%血清培养基中的细胞，差异显著(P ＜0.05)。详见表1。

表1 3 种浓度血清培养的细胞光密度值

3 小结与讨论

本次试验，采用组织块贴壁方法培养的成纤维细胞形态良好，且在细胞传代后极少出现无法贴壁的死细胞，稳定传代10 次后，细胞形态未出现衰老等变化，长满90%左右时，成群细胞呈束状或漩涡状生长。

据本次试验，10%～15%胎牛血清浓度即可满足金华猪耳缘组织成纤维细胞的生长需求，且10%、15%血清浓度对细胞生长影响的差异不显著。所以采用10%血清浓度培养金华猪耳缘组织成纤维细胞可以完全满足实验需要。血清浓度为5%时，则不能满足细胞生长需要，虽细胞仍在生长，但速度较慢，培养器皿底部尚未铺满，细胞一直处于增殖状态，但未出现平台期。

综上所述，血清浓度对金华猪耳缘组织成纤维细胞生长影响比较明显，血清浓度为10%、15%时，二者对细胞生长状况的影响差异不显著(P ＞0.05)，二者与血清浓度为5%时对生长状况的影响，则差异显著(P ＜0.05)，表明不同血清浓度的培养体系在对体外培养金华猪耳缘组织成纤维细胞有着明显影响。

血清是一种很复杂的混合物，含有丰富的细胞生长必须的营养成分，能维持细胞成活，促进细胞增殖。可能与血清中所含VEGF、EGF、bFGF 等多种细胞生长因子有关，细胞生长因子对细胞增殖影响均存在一定的量效关系［7］。因此，笔者认为在血清浓度为10%条件下采用组织块贴壁培养法获取的原代金华猪耳缘组织成纤维细胞形态良好、增殖能力较强，群体倍增时间较短。

［1］程旭梅，倪黎纲，吴晓伟，等.猪皮肤组织块冷冻保存方法的研究［J］.扬州大学学报:农业与生命科学版，2008，29(3):67－71.

［2］Betthauser J， Forsberg E， Augenstein M， et al.Production of cloned pigs from in vitro systems［J］.Nat Biotechnol，2000，18(10):1055－1059.

［3］Polejaeva I，Chen S，Vaught T，et al.Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells［J］.Nature，2000，407(6800):86－90.

［4］Lai L，Kolber-Simonds D，Park K，et al。Production of alpha-1，3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning ［J］.Science，2002，295(5557):1089－1092.

［5］吴常信.动物遗传资源保存的理论与技术——21 世纪动物农业持续发展的种质基础［J］.云南大学学报，1999，21(1):7－10.

［6］周福临，张娇，等.不同浓度血清对人成纤维细胞生长的比较研究［J］.中国美容整形外科杂志，2007，18(4):308－311.

［7］李云剑，林樾，燕辛，等.培养基血清浓度对人表皮干细胞增殖分化的影响［J］.现代生物医学进展，2010，20(3):3831－3833.