柠檬黄褪色光度法检测H2O2-Fe2+产生的羟自由基

李建晴，李垠俊，鄯 慧，蔡雪梅

（晋中学院化学化工学院，山西 晋中 030600）

柠檬黄褪色光度法检测H2O2-Fe2+产生的羟自由基

李建晴，李垠俊，鄯 慧，蔡雪梅

（晋中学院化学化工学院，山西 晋中 030600）

利用Fenton反应产生羟自由基（·OH）,加入柠檬黄显色剂,·OH与显色剂发生作用使柠檬黄褪色，用分光光度计测定其ΔA值的变化，从而间接测定产生羟自由基的量.对抗坏血酸、盐酸羟胺在不同溶剂中的抗羟基自由基氧化性能进行了比较.结果表明：抗坏血酸、盐酸羟胺50%乙醇溶液的抗氧化能力比抗坏血酸、盐酸羟胺水溶液的抗氧化能力强.4种体系中的回收率：抗坏血酸、盐酸羟胺50%乙醇溶液的回收率分别为106.6%、102.4%，抗坏血酸、盐酸羟胺水溶液的回收率分别为92.2%、94.0%.

羟自由基；柠檬黄；H2O2-Fe2+；EDTA-Fe（II）

羟自由基（·OH）是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基[1-4]，具有氧化效率高、反应速度快的特点，羟自由基会损伤细胞，引发各种疾病[5].药物的抗氧化性，药剂对羟基自由基阻碍作用的标志之一是·OH的清除率，羟自由基的检测一直以来都受到广泛关注.寻找操作快速、简便检测·OH的方法，对抗氧化药物的选取有一定的意义[6-8].本文利用Fent on反应产生羟自由基（·OH），加入柠檬黄显色剂，· OH与显色剂发生作用使柠檬黄褪色，用分光光度计测定其ΔA值的变化，从而间接测定产生羟自由基的量.对抗坏血酸、盐酸羟胺在不同溶剂中的抗羟基自由基氧化性能进行了比较，为羟自由基（·OH）的检测、药剂的选择等提供了依据.

1 试验部分

1.1 仪器、试剂

TU-1901型双光束紫外可见分光光度计；电子天平；pH S-2ST数显酸度计；H H-S恒温水浴锅；722s可见分光光度计.

柠檬黄（天津多福源实业有限公司）配制0.3 m mol/L的溶液；H2O2（体积分数30%）：使用时按需稀释；3.8 m mol/L的EDTAFe（II）溶液；pH=4.30的三酸缓冲溶液；1.0 mg/mL的抗坏血酸和盐酸羟胺的抗氧化剂溶液.

1.2 羟自由基试验方法

在10 mL带刻度比色管中，顺序加入2 mL pH=4.30的三酸缓冲溶液，0.7 mL的3.8 m mol/L EDTA-Fe2+，2.0 mL 0.3 m mol/L柠檬黄，0.6%H2O2溶液0.7 mL，定容30℃下保持30 m i n，选定λmax=425 nm，测其A425.加H2O2前体系的吸光度为A0，加H2O2后体系的吸光度为Ab，羟自由基的产生量用ΔA=A0-Ab来表示.

在加H2O2之前加入一定量的抗坏血酸，盐酸羟氨等还原试剂，λmax=425 nm，测吸光度As，则抗羟基自由基氧化率S的表观值计算公式为：

2 结果与讨论

2.1 实验条件的选择

2.1.1 吸收光谱

按照实验方法作吸收光谱曲线见图1.结果表明，非氧化体系和氧化体系中，在λmax=425 nm处都有最强吸收，但在加H2O2的柠檬黄体系A比未加的要小，这表明羟自由基对柠檬黄具有比较强的褪色作用.

2.1.2 酸度的影响

配制pH 1.82、2.00、2.51、3.06、4.30、5.04、6.00、7.20、8.29、9.22、10.21和11.21的系列体系，按实验方法测量各个溶液的吸光度ΔA425.实验结果如图2.结果表明：在pH=4.30时，体系的ΔA425达最大值，故本实验选用pH为4.30的缓冲体系.

图1 柠檬黄吸收曲线，1-非氧化体系（未加H2O2），2-氧化体系（加H2O2）

图2 三酸缓冲溶液酸度的影响

2.1.3 柠檬黄用量的影响

试验测定了柠檬黄浓度对体系吸光度A425的影响.结果表明，随着加入柠檬黄体积分数增大，测定的Δ A425值也增大，而在柠檬黄达到0.06 m mol/L时，体系ΔA425值较大，且A0，Ab处于测量误差较小的范围.

2.1.4 H2O2用量的影响

依据实验方法改变加入H2O2的量，测定吸光度A425.结果见图3.随着加入H2O2的量的增大，体系的Δ A425值增大，可见，Fent on反应产生的·OH量和体系中H2O2的加入的量是成正比的.结果表示，本试验中当加入体积分数达到H2O20.6%的时候，体系的ΔA425达到最大，此时，A0、Ab也都处于误差较小的范围，本试验选择加入0.6%的H2O2溶液是0.7 mL.

图3 H202用量的影响

2.1.5 反应时间的影响

据实验方法考查了反应时间对体系吸光度的影响，试验结果表明：随着反应时间的增加，体系ΔA425增长变慢，褪色速度大幅下降.当反应时间达30 m i n后，在30℃下ΔA425增加较慢.本试验选用30 m i n作为最佳反应时间.

2.1.6 反应温度的影响

按实验方法，分别在25至50度之间，测定了体系的ΔA425.试验的结果表明：随着反应体系温度的增加，其ΔA425逐渐增加，实验选择30℃作为比较适宜的反应温度.

2.1.7 EDTA-Fe（II）加入量的试验

按试验方法加入体积不同的3.8 m mol/L EDTA-Fe（II）试液，待完全反应后，同样测吸光度A425.如图4所示.试验表明：随加入的EDTA-Fe（II）增大，吸光度ΔA425值也逐渐增大.而在加入量达到0.7 mL时，体系ΔA425最大，其后达到饱和.本试验中，EDTA-Fe（II）适宜用量定为加入0.7 mL.

2.2 还原剂对羟自由基的清除作用的试验

依据试验方法，试验对还原剂抗坏血酸以及盐酸羟胺两种试剂对羟自由基的还原清除能力进行了测定，结果如图5.

实验表明：两种还原剂对羟自由基的清除作用能力都与其加入的量成正相关,随着还原剂加入量的增加，其对羟自由基还原的效果也增大，最后，当还原剂用量增大到一定的量以后，其对羟自由基还原的清除率（S）增长速度变小到基本不变，说明加入的还原剂及抗氧化剂的药效也趋于了饱和.

图4 EDTA-Fe2+用量的影响

图5 抗氧化剂用量对抗羟自由基清除率的影响

2.3 回收率的实验

依照实验方法，在还原剂清除羟自由基没有达饱和的用量区间作了抗坏血酸50%乙醇溶液、盐酸羟胺50%乙醇溶液、抗坏血酸水溶液和盐酸羟胺水溶液的标准回收率实验，表1所示为4次实验结果的平均值.

表1 回收率实验

结果表明：抗坏血酸、盐酸羟50%乙醇溶液的回收率大于其相应水溶液的回收率；无论在50%乙醇溶液中，还是在水溶液中，抗坏血酸的抗氧化能力较盐酸羟胺强.

3 结论

a.试验方法方便，快捷，所用设备简单，能方便地测定羟自由基.

b.试验方法可对清除羟自由基的还原剂用来进行筛选.对2种还原剂的不同溶剂的还原羟自由基的性能进行了比较，结果为:抗坏血酸50%乙醇溶液＞盐酸羟胺50%乙醇溶液＞抗坏血酸水溶液＞盐酸羟胺水溶液.这说明抗氧化剂用乙醇溶剂配置抗羟自由基氧化性能增强.

c.对样品做了回收率实验，抗坏血酸、盐酸羟胺50%乙醇溶液的回收率分别为106.6%、102.4%，抗坏血酸、盐酸羟胺水溶液的回收率分别为92.2%、94.0%，回收率较高，结果较好.

［1］韩鹤友，何治柯，曾云鹤.羟自由基的分析研究进展［J］.分析科学学报，2001，17（1）：83～87.

［2］ANGELOPOULOU R，LAVRANOS G,M ANOLAKOU P.ROS i n t he agi ng m al e:M odeldi seaseswi t h ROS-rel at ed pat hophysi ol ogy［J］.Reproduct i veToxi col ogy，2009，2（28）：167～171.

［3］文镜，刘璇，赵建.荧光法及化学发光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用［J］.中国酿造，2009（11）：130～133.

［4］丛建波，孙存普，莫简.自旋捕集短寿命自由基的低温保存［J］.生物化学与生物物理进展，2003，20（4）：326～327.

［5］王允中，等.自由基与酶-基础理论及其在生理学和医学中的应用［M］.北京：科学出版社，1989.

［6］杨芬，张瑞萍，贺玖明，等.羟自由基的产生、捕集及检测方法［J］.药学学报，2007，42（7）：692～697.

［7］陈培榕，李景虹，邓勃.现代仪器分析试验与技术［M］.北京：清华大学出版社，2006，17（11）：65～67.

［8］续洁琨，姚新生，栗原博.抗氧化能力指数（ORAC）测定原理及应用［J］.中国药理学通报，2006，22（8）：124～130.

Hydroxyl Radicals Generated by H2O2-Fe2+are Detected with Lemon Yellow Fading Spectrophotometric

LI Jian-qing，LI Yin-jun，SHAN Hui，CAI Xue-mei
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Jingzhong University，Jingzhong Shanxi，030600 China）

The hydroxyl free radicals which are produced by Fenton reaction can make the lemon yellow fade to measure the discharge of hydroxyl free radicals indirectly.Through the research of the determination conditions,optimum experiment conditions are obtained.And the article makes a comparison of the performance of different solution of Ascorbic acid and hydroxylamine hydrochloride on the resistance to the hydroxyl free radical oxidation.Results showed that the antioxidant capacity of the 50% ethanol solution of ascorbic acid and hydroxylamine hydrochloride is better than the aqueous solution of ascorbic acid and hydroxylamine hydrochloride.The recovery rate of 50%ethanol solution of the ascorbic acid and hydroxylamine hydrochloride are 106.6%,102.4%respectively.The recovery rate of the aqueous solution of ascorbic acid and hydroxylamine hydrochloride are 92.2%,94.0%respectively.

Hydroxyl radical;Lemon yellow;H2O2-Fe2+;EDTA-Fe2+

O657

A

1673-1808（2014）03-0028-04

（编辑 杨乐中）

2014-03-08

国家自然科学基金（No：21175086），山西省高校科技研究开发项目（No：20111026），山西省大学生创新实验项目（NO：2012350）.

李建晴（1963-），女，山西昔阳人，晋中学院化学化工学院，教授，研究方向：光谱分析；

李垠俊（1991-），男，山西忻洲人，晋中学院化学化工学院；

鄯慧（1990-），女，山西阳泉人，晋中学院化学化工学院；

蔡雪梅（1961-），女，山西运城人，晋中学院化学化工学院，教授，研究方向：光谱分析.