血府逐瘀方对动脉粥样硬化大鼠MMP-2及TIMP-2的影响

董超，马新乔，高军秒，李芸

（1. 河北大学基础医学院，河北 保定071000；2. 蠡县县医院，河北 蠡县071400；3. 高碑店市医院，河北 高碑店074000）

·基础研究·

血府逐瘀方对动脉粥样硬化大鼠MMP-2及TIMP-2的影响

董超1，马新乔2，高军秒3，李芸3

（1. 河北大学基础医学院，河北 保定071000；2. 蠡县县医院，河北 蠡县071400；3. 高碑店市医院，河北 高碑店074000）

目的 通过研究血府逐瘀方对动脉粥样硬化大鼠动脉斑块组织基质金属蛋白酶2（MMP-2）及基质金属蛋白酶抑制因子2（TIMP-2）表达的影响，探讨血府逐瘀方抗动脉粥样硬化作用的可能机制。方法 将30只SD大鼠随机分为对照组、模型组、血府逐瘀方组。对照组给予正常饲料，采用腹腔注射维生素D3及饲喂高脂饲料的方法建立大鼠动脉粥样硬化模型。实验结束后，取大鼠主动脉粥样硬化组织检测MMP-2和的TIMP-2的表达水平。结果 HE染色光镜下显示，对照组动脉壁形态结构完整，模型组动脉内膜粗糙，中膜平滑肌增生排列紊乱，血府逐瘀方组形态介于二者之间；免疫组化观察，与对照组相比，模型组和血府逐瘀方组MMP-2的表达显著升高，TIMP-2的表达显著下降；血府逐瘀方组与模型组相比，MMP-2表达显著降低，TIMP-2表达显著升高。结论 血府逐瘀方能抑制动脉粥样硬化的形成，其机制可能与其能下调动脉粥样硬化大鼠动脉粥样硬化组织内的MMP-2的表达及升高TIMP-2表达有关。

血府逐瘀方；动脉粥样硬化；MMP-2；TIMP-2

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是多种因素长期作用下的慢性血管性疾病，流行病学表明，动脉粥样硬化在中国的发病率逐年增高，其引起的心、脑、肾等重要器官的损害，导致患者出现了较高的病死率和致残率，严重威胁了患者的生命健康。

近年来研究及笔者前期的实验结果[1-7]表明，血府逐瘀方可以通过调节血脂代谢、内皮细胞的活性因子，降低炎症因子的水平、调节细胞外基质（ECM）的代谢等起到抗动脉粥样硬化的作用。但该方对动脉粥样硬化大鼠组织基质蛋白酶2（MMP-2）及其抑制因子2（TIMP-2）表达的影响鲜有报道。该实验在饲喂SD大鼠过程中给予高脂饲料并用维生素D3腹腔注射的方法制作了动脉粥样硬化大鼠动物模型，通过免疫组织化学方法检测动脉粥样硬化组织中MMP-2和TIMP-2表达水平，研究该方在动脉粥样硬化形成过程中的作用和影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠30只，雄性，体质量（200±10）g，由河北医科大学动物中心提供，（动物许可证编号：909047）

1.2 药品与试剂

VitD3注射液、胆固醇、丙基硫氧嘧啶由上海倍卓生物科技有限公司生产，购自保定市华新试剂公司。兔抗鼠MMP-2和TIMP-2抗体、免疫组化试剂盒均购自北京中杉生物有限公司。血府逐瘀方（草药购自保定市乐仁堂药店）[8]严格按照该方煎制方法制成含生药浓度为2 g/mL的药液，4 ℃保存备用。高脂饲料由河北医科大学实验动物中心提供。

1.3 实验设备

BCD-133ES冰箱（海尔电器股份有限公司生产）；BMJ-B型生物组织包埋机（常州市中威电子仪器有限公司生产）；A130375型切片机（莱卡仪器设备有限公司）；HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统（武汉千屏影像技术有限责任公司）。

1.4 实验分组及造模

30只SD大鼠随机分为对照组、模型组、血府逐瘀方组。对照组用普通饲料喂养，模型组及血府逐瘀方组均用高脂饲料喂养[4]。实验开始后，模型组和血府逐瘀方组大鼠分3 d腹腔注射总剂量为70万单位的维生素D3[9]。实验中，对照组饲喂普通饲料，血府逐瘀方组给予高脂饲料喂养的同时每天给予血府逐瘀方混悬液12 g/kg灌胃；模型组每天饲喂高脂饲料同时灌胃等体积的蒸馏水。实验至第12周。

1.5 病理形态学及免疫组化观察

12周末实验结束，3%戊巴比妥钠麻醉动物（30 mg/kg），剖腹取大鼠主动脉弓至腹主动脉分叉处的主动脉，通过肉眼观察，取主动脉弓处动脉斑块较明显的血管约1 cm，甲醛固定，石蜡包埋, 切片, HE染色观察。免疫组织化学法严格按照说明书进行操作，检测MMP-2和TIMP-2表达水平。

1.6 结果判定

MMP-2和TIMP-2阳性表达为细胞膜/胞质内出现棕黄色颗粒。用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统对免疫组化结果进行分析，每张切片取不同的10个高倍视野（400倍），测量粥样硬化斑块阳性视野的面积，取其平均值做为免疫组化阳性结果。

1.7 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件包进行处理，计量资料以x±s表示，多个组间比较使用完全随机设计方差分析F检验，组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1 HE染色光镜下观察

对照组动脉管壁各层形态结构正常，内膜下未见泡沫细胞（图1a）。模型组显示动脉内膜粗糙，向管腔内稍隆起，内膜下可见泡沫细胞，中膜平滑肌增生排列紊乱，弹力纤维融合，可见早期动脉粥样硬化的形态改变（图1b）。血府逐瘀方组动脉内膜无明显增厚，泡沫细胞不明显，平滑肌细胞排列较规整（图1c）。

图1 各组主动脉病理变化（HE染色×400）

2.2 MMP-2和TIMP-2在动脉粥样硬化斑块的表达

模型组与对照组相比，动脉斑块MMP-2阳性表达程度升高，TIMP-2阳性表达程度降低；血府逐瘀方组与模型组相比，动脉斑块MMP-2表达显著降低，TIMP-2表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2、表1。

图2 各组动脉内膜MMP-2及TIMP-2 免疫组织化学染色（×400）

表1 各组动脉粥样硬化组织MMP-2和TIMP-2阳性表达比较(n=10，x±s)

3 讨 论

动脉粥样硬化是在多因素影响下的长期慢性的病变过程，在其发生发展的过程中，脂质物质在内膜的沉积、血管内膜的损伤、单核细胞被激活并释放大量的生长因子及细胞活性因子，细胞外基质（ECM）代谢失调等一系列的变化，导致动脉管壁中膜平滑肌细胞（VSMC）大量增殖，并向内膜下迁移，形成了动脉粥样斑块[10]。

VSMC增殖并从动脉中膜向内膜迁移的重要原因是ECM的合成与降解的失衡[11]，因此对于保持ECM合成与降解的平衡是防治动脉粥样硬化重要的切入点。MMPs是一类能调节ECM代谢平衡的重要的蛋白水解酶，正常生理情况下，血管内皮细胞不分泌或分泌很少的MMPs，故在血管组织中检测不到其活性[12]，动脉粥样硬化发生过程中，各种病理过程如脂质的沉积，巨噬细胞的聚集、活化、局部组织缺血、缺氧等因素的刺激下，受损被激活的内皮细胞及浸润的炎细胞可表达大量的MMPs，其中与动脉粥样硬化发生关系最为密切的是MMP-2[13]，过量的MMP-2可降解基底膜、明胶和多种胶原成分，促进平滑肌的增殖，平滑肌在形成泡沫细胞的过程中又可以继续分泌大量的MMP-2，降解ECM，加速动脉粥样硬化的发生和进展[14]。

在动脉粥样硬化的发生发展中， TIMP-2主要由巨噬细胞和上皮细胞产生，它是一种非糖基化蛋白，对MMPs家族尤其是MMP-2有明显的抑制作用[15]，能延缓和阻止ECM被降解，调节ECM的失衡及抑制平滑肌的增殖和迁移，起到抗动脉粥样硬化的作用。

动脉粥样硬化在祖国传统医学诊治中没有明确记载，辨证多将其归为“血瘀”“痹症”的范畴；临床中活血化瘀的治法治疗动脉粥样硬化疗效比较显著，一直是中医药抗动脉粥样硬化的热点之一，血府逐瘀方是活血化瘀代表方之一，出于王清任的《医林改错》。笔者前期的研究结果显示，本方可通过对脂质代谢、血管活性物质等的调节，起到防治动脉粥样硬化的作用[3-4]。

本实验免疫组织化学染色结果表明，该方可使动脉粥样硬化斑块组织中MMP-2表达降低、TIMP- 2表达升高，提示该方能通过调节MMP-2/TIMP-2的平衡，延缓和阻止ECM被降解，起到抑制动脉粥样硬化形成的作用。本实验进一步通过HE染色光镜下进行形态学观察，血府逐瘀方组动脉管壁动脉内膜下泡沫细胞不明显，平滑肌细胞排列较规整，较模型组形态出现明显改善。证实该方可通过调节MMP-2/TIMP-2的平衡，抑制ECM的降解过程，发挥其防治动脉粥样硬化的作用。

[1] 谢辉, 罗尧岳, 周小青. 血府逐瘀汤及其拆方对动脉粥样硬化兔血脂、血流动力学的影响[J]. 湖南中医药大学学报, 2008, 28(2): 13-15.

[2] 董超, 耿兆辉, 高飒. 血府逐瘀汤的现代临床应用和实验研究进展[J]. 时珍国医国药, 2009, 20(12): 3122-3123.

[3] 耿兆辉, 寿宝栋, 刘辉. 血府逐瘀汤对动脉粥样硬化大鼠血脂及血管活性物质的影响[J]. 河北大学学报: 自然科学版, 2011,31(3): 304-308.

[4] 黄威, 董超, 刘辉. 血府逐瘀汤对动脉粥样硬化大鼠前列环素及血栓素A2的影响[J]. 时珍国医国药, 2012, 23(5): 1130-1132.

[5] 董超, 黄威, 耿兆辉. 血府逐瘀汤对动脉粥样硬化大鼠细胞间粘附分子和脂质过氧化物的影响[J]. 河北大学学报: 自然科学版, 2012, 32(6): 650-654.

[6] 董超, 黄威, 杨阳. 血府逐瘀汤抗大鼠动脉粥样硬化作用及其机制[J]. 医药导报, 2013, 32(5): 579-582.

[7] 黄威, 董超. 血府逐瘀汤对动脉粥样硬化大鼠MMP-9及TIMP-1的影响[J]. 医学研究与教育, 2013, 30(5): 8-12.

[8] 段富津. 方剂学[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1995: 123, 197, 204-205.

[9] 刘磊, 焦向英, 张袆芳, 等. 高脂饲料及维生素D3联合应用建立大鼠动脉粥样硬化模型[J]. 山西医科大学学报, 2005, 36(6): 681.

[10] HARRISON D, GRIENDLING K K, LANDMESSER U, et al. Role of oxidative stress in atherosclerosis [J]. Am J Cardiol, 2003, 91(3A): 7A-11A.

[11] MALIK N, GREENFIELD B W, WAHL A F, et al. Activation of human monocytes through CD40 induces matrix matalloproteinases[J]. J Immunol, 1996, 156(10): 3952-3960.

[12] GALIS Z S, SUKHOVA G K, LARK M W, et al. Increased expression of matrix metalloproternases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atheros clerotic plaques[J]. J Clin Invest, 1994, 94(6): 2493-2503.

[13] 张小梅, 翟桂兰. 炎症因子与动脉粥样硬化的研究进展[J]. 牡丹江医学院学报, 2008, 29 (1): 91-93.

[14] LI Z, LI L, ZIELKE H R, et al. Increased expression of 72-kd type Ⅳ collagenase(MMP-2)in human aortic atherosclerotic lesions[J]. Am J Pathol, 1996, 148 (1) : 121-128.

[15] PANG I H, HELLBERG P E, FLEENOR D L, et al. Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human trabecular meshwork cells [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003, 44 (8): 3485.

（责任编辑：刘俊华）

Effects of Xuefu Zhuyu Decoction on MMP-2 and TIMP - 2 in atherosclerotic rats

DONG Chao1, MA Xinqiao2, GAO Junmiao3, LI Yun3
(1. College of Basic Medical Science of Hebei University, Baoding 071000, China; 2. Lixian County Hospital, Lixian 071400, China; 3. Gaobeidian Hospital, Gaobeidian 074000, China)

Objective To explore mechanism of Xuefu Zhuyu Decoction on the expression of matrix metalloproteianse-2(MMP-2) and tissue metalloproteinase inhibitor -2 (TIMP - 2) in atheroselerotic rats. Methods 30 SD rats were randomly divided into the control group, model group and Xuefu Zhuyu Decoction group. Subcutaneous injection vitD3with high fat feeding was conducted to reproduce atheroselerotic rats model. After the experiment, immunohistochemistry staining was performed to detect the level of MMP - 2 and TIMP - 2 protein expression. Results Under light microscope, arterial structure of the control group was completed, artery intima of the model group was rough, the smooth muscle was disordered arrangement, Xuefu Zhuyu Decoction forms was between the two; Compared with the control group, the expressions of MMP-2 was increased significantly and the expressions of TIMP-2 was decreased significantly in in model group and Xuefu Zhuyu Decoction group. Compared with the model group, the expressions of MMP-2 protein in Xuefu Zhuyu Decoction group were decreased significantly, the expressions of TIMP-2 protein were increased significantly.Conclusion The Xuefu Zhuyu Decoction Could downregulate the expressions of MMP-2 and upregulate he expressions of TIMP-2 and inhibit the formation of atherosclerosis.

Xuefu Zhuyu Decoction; Atheroselerosis; MMP-2; TIMP-2

R363

A

1674-490X(2014)03-0001-05

2014-05-11

河北省中医药管理局2011中医药类科研计划课题（2011107）； 2013年科学技术研究与发展指导计划（13ZF019）

董超（1978—），男，河北保定人，讲师，硕士，主要从事心血管病理的研究。E-mail：dc4132988@163.com