碘克沙醇对于肾功能不全大鼠肾损伤分子-1水平及肾小管上皮细胞凋亡率的影响

王娴君，吴尚勤，姚青海，董国峰

（1. 天津医科大学第四中心临床医院，天津 300000；2. 天津市胸科医院心内科，天津 300000）

碘克沙醇对于肾功能不全大鼠肾损伤分子-1水平及肾小管上皮细胞凋亡率的影响

王娴君1，吴尚勤2，姚青海2，董国峰2

（1. 天津医科大学第四中心临床医院，天津 300000；2. 天津市胸科医院心内科，天津 300000）

目的 碘克沙醇对于肾功能不全大鼠肾损伤分子-1(kidney injury molecule-l，KIM-1)及肾小管上皮细胞凋亡率的干预研究。方法 将48只Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组，模型组，碘克沙醇组1、碘克沙醇组2 (n=12)。模型组与碘克沙醇组均采用右肾切除及左肾动脉缩窄法制作肾损伤模型。分别在术前、术后2周内隔日经内眦静脉取血测定BUN、SCr及取尿测KIM-1值。术后第3周对模型组静脉注射生理盐水，碘克沙醇组1注射碘克沙醇（5 mL/kg）碘克沙醇组2注射碘克沙醇（10 mL/kg），观察碘克沙醇组在应用对比剂前与应用对比剂后3 h、24 h、48 h、72 h、7 d血尿素氮、肌酐和尿KIM-1的变化；术后第24 h、72 h、第7天，每组随机选取3只大鼠处死。采取TUNEL法测定并比较这四组动物的肾小管上皮细胞凋亡率。结果 （1）与对照组相比，模型组血清BUN、SCr水平于术后第2天急剧升高(P＜0.01)，达术前2倍左右。之后逐步下降，手术后2周时稳定于术前1.5～2.0倍水平，但尿KIM-1无显著变化(P＞0.05)。（2）与模型组相比，碘克沙醇组2在注射后24 h、72 h、第7天BUN、SCr、KIM-1、肾小管上皮细胞凋亡率明显升高（P＜0.01），碘克沙醇组2尿KIM-1水平在碘克沙醇注射后3 h即升高，明显早于碘克沙醇组1的升高，差异具有显著性（P＜0.01）。结论 通过采用左肾动脉缩窄及右肾切除的方法能制备慢性轻中度肾衰竭动物模型；碘克沙醇可引起慢性肾衰竭动物的急性肾损伤，具体机制可能和该对比剂诱导肾小管上皮细胞凋亡有关。KIM-1能作为对比剂肾病的早期预测指标。不同浓度的对比剂对肾小管的损伤作用是不同的。

急性肾损伤；肾损伤分子-1；碘克沙醇；肾小管损伤；Wistar大鼠

随着近年来介入技术的广泛开展，对比剂大量应用于临床，由此引起对比剂肾病的发病率亦逐渐增高。对比剂肾病（contrast-induced nephropathy，CIN）是指血管内注射碘对比剂后48h内，在排除其他病因前提下，肾功能发生损害，血肌酐（serum creatinine，SCr）较应用前升高≥25%或≥44.2μmol/L[1-3]，通常以医院获得性急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的形式出现。但是，在CIN的发生和传统指标SCr、BUN升高之间有一定的时间间隔，而早期诊断CIN标志物的缺乏致使延误治疗，导致CIN的病死率增加。因此如何早期诊断和早期治疗是改善CIN患者预后的重要措施[4-5]。KIM-1是一种新的I型跨膜糖蛋白，它在正常肾组织中几乎没有表达。但在各种损伤因素所导致的急性肾损伤可使肾小管上皮细胞呈高表达[6]，是一种敏感性和特异性都较高的诊断肾小管损伤的标志物，并且尿KIM-1的升高早于血肌酐。但其能否作为CIN的早期生物标志物，目前还无相关报道。另外，随着老龄化以及合并疾病（如高血压病、糖尿病、肾动脉硬化等）发病率逐年升高，临床患者往往会同时伴有不同程度慢性肾衰竭，为了贴近临床，本实验拟通过前瞻性研究，探讨对比剂对于慢性肾衰竭大鼠急性肾损伤早期预测指标KIM-1的影响，并探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

1.1.1 动物来源

3～4月龄健康Wistar雄性大鼠48只，体质量180～260 g（解放军军事医学科学院实验动物中心），适应性喂养1周后，经内眦静脉取血，测BUN、SCr值。

1.1.2 实验试剂盒

KIM-1 ELISA检测试剂盒（购自上海兰基因公司）、TUNEL检测试剂盒（购自上海罗氏公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 肾衰竭模型的制作

模型组动物通过缩窄左侧肾动脉30%，切除右侧肾脏的方法构建慢性肾衰竭模型。具体方法：术前禁食，仅给予葡萄糖水8 h。预先生理盐水配好3%的戊巴比妥钠，将大鼠称重后，按照40 mg/kg方法进行腹腔注射麻醉。腹部正中切口，钝性分离右侧肾静脉及输尿管，将上述结构一起结扎后切除右侧肾脏。从腹主动脉分支处钝性分离左侧肾动脉，将左肾动脉轻轻挑起后，平行放置7号钝针头（直径0.7 mm），将肾动脉与针头一起结扎后，肾脏由于缺血变白色，缓慢平行抽出针头，使肾动脉部分缩窄，狭窄处直径为 0.7 mm，确认肾脏恢复粉红色，结扎部位无出血后关闭腹腔。术后禁食并予以葡萄糖盐水耳缘静脉间断注射12 h，后逐步恢复正常饮食。模型组术前、术后2周隔日经内眦静脉取血测定血清BUN、SCr值。

1.2.2 动物分组

将上述48只动物随即分为对照组、模型组、碘克沙醇组1及碘克沙醇组2，于术后第3周对模型组静脉注射生理盐水和碘克沙醇组1静脉注射碘克沙醇5 mL/kg，碘克沙醇组2静脉注射碘克沙醇10 mL/kg。

1.2.3 血清及尿液指标测定

两组动物内眦静脉取血测定BUN、SCr值。分别于注射前、注射后第1、3、7天随机选取3只大鼠，经下腔静脉取血测定BUN、SCr值；对比剂注射前、术后第3 h及第1、3、7天分别收集大鼠尿液， ELISA法检测尿中KIM-1值。

1.2.4 肾脏病理及肾小管上皮细胞凋亡率检测

术后第24 h、72 h、第7天，每组随机选取3只大鼠处死。切除左侧肾脏，剥离肾包膜后置于10%甲醛中固定，制备石蜡包埋切片。每张切片于400倍显微镜下随机选取10个肾小管间质视野，镜下计数高倍视野中调亡肾小管上皮细胞的百分比即肾小管细胞凋亡率，以每张切片10个高倍视野凋亡率的总和的均值作为肾小管细胞的凋亡率。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件对各变量作统计学分析，计量资料均采用x ± s表示，组间资料比较采用单因素方差分析，组内资料比较采用配对样本t 检验，以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 动物模型效果检测

模型组大鼠血清BUN、SCr水平在术后第2天开始急剧升高至术前2倍水平；然后逐渐下降，手术后2周时稳定于术前1.5～2.0倍水平。说明肾衰竭大鼠的模型制作的成功。手术前后KIM-1无明显变化，经统计学分析差异无统计学意义（P＞0.05），说明该模型成功做成慢性肾衰竭模型。见表1。

表1 模型组与对照组大鼠手术前后血清BUN、SCr、KIM-1的变化（，n=12）

表1 模型组与对照组大鼠手术前后血清BUN、SCr、KIM-1的变化（，n=12）

**与对照组组同时刻相比，P＞0.05(t术后24h=1.259，t术后72h=1.362，t术后7d=1.355) 。

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2.2 不同剂量对比剂使用前、后血清SCr及尿KIM-1的变化

碘克沙醇组KIM-1显著升高，经统计学分析差异有统计学意义（P＜0.01），说明对比剂对肾脏的急性损伤作用是显著的，术后3 h 的KIM-1水平明显高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 不同剂量对比剂使用前、后血清SCr及尿KIM-1的变化（，n=12）

表2 不同剂量对比剂使用前、后血清SCr及尿KIM-1的变化（，n=12）

**与模型组同时刻相比，P＜0.01。

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2.3 碘克沙醇组2与模型组肾小管细胞凋亡的比较

高倍显微镜观察到：模型组仅可见极少凋亡现象，而碘克沙醇组2可见肾小管细胞大量凋亡（图中肾小管细胞核被染成褐色），通过计算碘克沙醇组2为56.12±10.56，模型组为5.20±4.49，差异有统计学意义（t=16.60，P＜0.01）。详见图1、2。

图1 模型组生理盐水注射后肾小管细胞凋亡情况

图2 碘克沙醇组2注射后肾小管细胞凋亡情况

3 讨论

CIN是临床上导致患者住院时间延长以及有较高病死率的主要疾病之一，为老年患者常见不良事件[7]。随着老龄化的到来，以及合并疾病（如高血压病、糖尿病、肾动脉硬化等）发病率亦逐年升高，临床患者往往会同时伴有不同程度慢性肾衰竭，因此，如何早期发现、早期治疗急性肾损伤显得尤为重要。关于大鼠肾衰竭模型的制作方法，有多种方法，如大鼠肾脏部分切除术[8]、药物引起肾功能不全[9]、双侧肾血管结扎[10]等均取得成功。本试验在结合上述几种肾衰竭模型的基础上，最终采用左侧肾动脉缩窄、右侧肾脏切除的方法制作成慢性衰竭大鼠的模型。结果表明对比剂造成了碘克沙醇组BUN、SCr、KIM-1变化，而模型组上述指标无明显变化，有效除外手术因素对于KIM-1的影响，提示该慢性肾衰竭动物模型制作成功，也就为对比剂造成KIM-1升高排除了干扰。应用对比剂后3 h模型组KIM-1即升高，差异具有显著性，表明对比剂成功诱导急性肾损伤。本文成功制成慢性肾衰竭大鼠急性肾损伤模型，更贴近临床。

本研究观察到，尿KIM-1在模型组大鼠应用造影剂后3 h就开始升高，明显提前于BUN、SCr的升高，差异具有显著性。表明KIM-1对急性肾损伤而言是一种新型的敏感的指标，可以成为诊断急性肾损伤并动态监测肾损伤全部过程的指标之一。本研究之所以采用尿KIM-1，一是因为尿液方便收集；二是多数患者对于密集采取血标本的依从性差；三是因为尿KIM-1的灵敏度高，对于早期肾损伤较敏感。

碘克沙醇即威视派克是一种新型的、第三代非离子型、六碘化、双体与血液等渗的X线对比剂。它的渗透压为290 mOsm/kg，是一种真正意义上的等渗造影剂。故本动物实验最大程度模拟临床对比剂引起的急性肾损伤，为对比剂肾病的早期诊断提供指导。作为反映肾小管急性损伤更为敏感及精确的指标，肾小管细胞的凋亡率碘克沙醇组明显高于模型组（P＜0.01），说明该实验在大鼠慢性肾衰竭基础上成功制作了对比剂诱导的急性肾小管损伤的模型，同时说明等渗型非离子造影剂碘克沙醇对肾小管的急性损伤作用是显著的。碘克沙醇组1的肾小管细胞的凋亡率明显低于碘克沙醇组2（P＜0.01）差异具有显著性，说明低浓度的对比剂对肾小管细胞的损伤较小，为临床低浓度造影剂、小剂量造影剂或水化法应用造影剂提供了理论支持，证明了在CIN中肾小管上皮细胞的凋亡确实存在，对CIN的发病机制有一定的研究意义。碘克沙醇在继ACC/AHA PCI 指南中作为Ⅰa 类推荐造影剂应用于慢性肾病患者冠脉造影或行PCI 术治疗后，又被作为Class I /A 推荐给高风险慢性肾病患者行冠脉造影或行PCI 术治疗，碘克沙醇是至今唯一得到这一最高级别推荐的造影剂[11]。

本研究表明KIM-1在ClN中是具有早期预警作用的生化指标之一，具有很好的临床应用前景，值得进一步的探讨与关注。

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（责任编辑：裘永强）

The impact of Iodixanol against kidney injury molecule-1 and the renal tubular cell apoptosis in rats with renal insufficiency

WANG Xianjun1, WU Shangqin2, YAO Qinghai2, DONG Guofeng2
(1. The Fourth Central Clinical Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300000, China; 2. Department of Cardiology, Tianjin Chest Hospital, Tianjin 300000, China)

Objective To observe the impact of Iodixanol against kidney injury molecule-1 and the renal tubular cell apoptosis in rats with renal insufficiency. Methods 48 male wistar rats were randomly divided into four groups: normal control group, model group, Iodixanol group1, Iodixanol group2 (n=12). Iodixanol groups and model group were applied the methods of left renal artery narrowing (30%), right nephrectomy to produce renal insufficiency model in rats respectively, in the preoperative and postoperative 2 weeks every other day bymeasuring the angular vein blood BUN, SCr and taking urine test of urinary kidney injury molecule-1 (KIM-1) values. After the first three weeks of intravenous saline model group, iodixanol (5 mL/kg)injection of iodixanol group 1, iodixanol (10 mL/kg)injection of iodixanol group 2, the changes of blood urea nitrogen, creatinine and urinary KIM-1 of the two iodixanol groups before applying the contrast agent, after 3 h, 24 h, 48 h, 72 h and 7 d were observed. Three rats of each group were sacrified in 24 h, 72 h and 7th day after injection of contrast agent. The renal tubular cell apoptosis rates were measured by TUNEL and the differences of each group were compared. Results After in the first two days of surgery, serum BUN, SCr levels in model group were significantly higher than that of the normal group (P＜0.01) and rised sharply up to about 2 times before surgery, Then gradually decreased after surgery stable at 1.5-2.0 times the preoperative levels two weeks. But the values of KIM-1 were no significant difference (P＞0.05). Compared with the model group, in 24 h, 72 h and 7th day after the injection of contrast agents, the values of BUN and SCr, the value of KIM-1 in urine and the rates of apoptosis of renal tubular cells in iodixanol group 2 were significantly increased higher than that of the model group (P＜0.01). After three hours iodixanol injection of iodixanol group 2, urinary KIM-1 levels that increased significantly earlier than the rise in the iodixanol group1, the difference was significant (P＜0.01). Conclusion By using the left renal artery narrowing and right nephrectomy method can be prepared with mild to moderate chronic renal failure in animal models; iodixanol can cause acute kidney injury of chronic renal failure animals and the specific mechanisms may induce renal contrast agent tubule epithelial cell apoptosis. KIM-1 can be used as a contrast agent nephropathy early predictors. Different concentrations of contrast agents for renal tubular injury are different.

acute kidney injury; kidney injury molecules-1; Iodixanol; tubular injury; wistar rat

R3

A

1674-490X(2014)02-0007-05

2014-02-27

王娴君（1977—），女，天津人，主治医师，在读硕士，主要从事冠心病的发病机制及介入治疗研究。

吴尚勤（1952—），女，天津人，主任医师，硕士，硕士生导师，主要从事冠心病的发病机制及介入治疗、心律失常电生理机制及治疗研究。E-mail: wushangqin1952@126.com