雏鸭混合感染基因A型和基因C型鸭甲肝病毒研究

马静, 汤承, 岳华

(西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041)

雏鸭混合感染基因A型和基因C型鸭甲肝病毒研究

马静, 汤承, 岳华

(西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041)

研究了2013年四川地区某鸭场暴发的基因A型鸭甲肝病毒(DHAV-A)和基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)的混合感染病例.疾病发生于20～25日龄雏鸭, 发病率25%～30%, 死亡率为20%～30%, 临死前出现明显的神经症状, 病死雏鸭肝脏肿大, 出血.利用双重RT-PCR从病死雏鸭的肝脏组织中同时检测出DHAV-A和DHAV-C.这是四川省养鸭密集区第一次发现雏鸭混合感染DHAV-A和DHAV-C的情况.此外, 对2009～2012年四川省各养鸭密集区鸭甲肝炎流行情况做了调查.一共从四川省养鸭密集区采集312份疑似鸭肝炎样本中检测出120份鸭甲型肝病毒性肝炎.其中基因C型鸭肝炎阳性率为75%, 基因A型鸭肝炎仅为25%, 未发现基因A型和基因C型混合感染情况.结果说明2009～2012年我省鸭病毒性肝炎以基因C型鸭甲肝病毒为优势病原.2013年, 开始出现DHAV-A和DHAV-C混合感染病例.因此如何采取有效措施应对其危害, 这应该引起养鸭界及相关部门的高度重视.

A型鸭甲肝病毒; C型鸭甲肝病毒; 混合感染; 流行病学调查

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的雏鸭的一种传染病,它以发病急、传播迅速、肝脏发生病变和死亡率高为主要特点[1].DHV由星状病毒科和小RNA病毒科成员组成,其中Ⅰ型DHV(DHV-1)属于小RNA病毒科, 同时又被重新命名成鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV),而Ⅱ型DHV(DHV-2)和Ⅲ型DHV(DHV-3)都被划分成星状病毒科[2-5].根据基因组的进化分析, DHAV又被分为3个基因型, 基因A型(DHAV-A)、基因B型(DHAV-B)和基因C型(DHAV-C), 分别对应原有的DHV-1、从台湾分离的 NDHV和从韩国和中国分离的 NDHV.其中 DHAV-A和 DHAV-B之间无血清交叉反应, 而 DHAV-A和DHAV-C仅存在有限的血清交叉中和反应[6-7].本实验室从疑似暴发肝炎的某鸭场病死雏鸭肝脏中分离出3株病毒, 经双重 RT-PCR方法鉴定及遗传进化分析, 确定为 DHAV-A和 DHAV-C混合感染.此外, 本实验采用双重RT-PCR方法对四川省养鸭密集区采集的312份疑似鸭肝炎样本进行检测, 结果显示, 120份病料检测出鸭甲肝病毒, 其中基因C型鸭甲肝病毒占75%, 基因A型鸭甲肝病毒仅占25%.

1 材料与方法

1.1 病料

1.1.1 四川省资阳市疑似暴发鸭肝炎疾病的某鸭场送检的3只25日龄病死雏鸭.同时在同一鸭场选取3只25日龄未发病的花边鸭.

1.1.2 2009年～2012年四川省养鸭密集区采集疑似鸭肝炎肝脏样本312份.

1.2 主要试剂

Trizol RNA提取试剂盒购自Invitrogen 公司; 反转录试剂盒购自上海博瑞克公司; DNA MakerⅠ购自Tiangen公司; Taq DNA聚合酶购和pMD19-T vector试剂盒购自TaKaRa公司; 大肠杆菌DH5α感受态细胞和胶回收试剂盒购自北京天根生物有限公司; 其它试剂为国产分析纯.

1.3 主要仪器

高速离心机centrifuge 5804(Eppendorf公司, 德国); 隔水式恒温培养箱(齐欣公司, 中国上海); 核酸蛋白检测仪DU800(Beckman公司, 美国); PCR仪: my cyclerTM, Bio-Rad公司, 美国; 凝胶成像系统: Doc2000, Bio-Rad公司,美国; 恒温水浴器(国华电器, 中国江苏); 超纯水仪Milli-Q(Millipore公司, 法国); 移液器(Eppendorf公司, 德国).

1.4 方法

1.4.1 样本采集

分别无菌采集死亡和健康雏鸭以及送检样本的肝脏组织, 剪碎后立即放入液氮中, 待样本完全冷冻后转入-80℃冰箱保存.

1.4.2 组织总RNA的提取及cDNA的合成

根据Trizol说明书分别提取雏鸭肝脏组织总RNA和采集样本肝脏总RNA, 然后按照反转录试剂盒说明书反转录成cDNA, 转入-80℃冰箱保存备用.

1.4.3 双重RT-PCR及测序

扩增DHAV-A 3C、3D区域的引物P1、P2和DHAV-C 3D区域的引物P3、P4按参考文献[8]报道设计, 引物信息见表1, 引物均由上海生工生物工程有限公司合成.以雏鸭肝脏cDNA为模板, 用双重RT-PCR方法检测DHAV-A和DHAV-C.双重RT-PCR的反应体系按参考文献[8].PCR产物用2%凝胶电泳, 胶回收试剂盒回收的目的片段与pMD-18T 连接, 转入DH5α感受态细胞, 挑选含有氨苄青霉素(Amp+)的LB平板上的单菌落进行菌落PCR, 阳性菌株送上海生工生物公司测序.

表1 引物信息Table 1 Information for primers

2 结果

2.1 临床诊断

2013年3月, 四川省资阳市某鸭场的20～25日龄花边鸭暴发一种疾病, 发病率25%～30%, 死亡率为20%～25%.病鸭出现厌食、嗜睡、侧卧、行走不稳、部分角弓反张, 在发病后1～3h内死亡.抗生素治疗无效.剖检可见死亡雏鸭的主要病变在肝脏, 表现为肝脏出血、肿大(见图1), 而健康雏鸭肝脏剖检无特征病变(见图2).

2.2 病料中DHAV-A和DHAV-C的检测

双重RT-PCR产物的电泳结果显示, 从病死雏鸭肝脏组织反转录cDNA中同时扩增出了长约为259bp和194bp的特异性条带, 测序结果与预期相符.而对健康雏鸭肝脏组织反转录cDNA检测的结果呈阴性, 结果见图2.

图1 死亡雏鸭肝脏出血、肿大Figure 1 The livers of died duckling swelling and hemorrhagic focus

图2 双重PCR检测DHAV-A和DHAV-C检测结果Figure 2.The result of amplification the DHAV-A and DHAV-C genes

2.3 采集样本检测

对2009～2012年间四川省养鸭密集区采集的312份疑似鸭肝炎样本进行双重RT-PCR检测, 电泳结果显示其中120份样本肝脏组织反转录cDNA中扩增出了长约为259bp或者194bp的特异性条带, 测序结果与预期相符.在这120份阳性样本中, 基因C型鸭肝炎样本为90份, 占75%; 基因A型鸭肝炎样本为30份, 占25%.部分检测电泳结果见图3.

图3 采集样本的部分双重RT-PCR检测结果Figure 3 Detection of the clinical samples by duplex RT-PCR

3 讨论

1945年DHAV-A被首次报道于美国长岛[1].直到现在DHAV-A仍然是对世界范围养鸭业的严重的威胁.近年来DHAV-C作为一个新发现的基因型, 在韩国和中国广泛流行[9].2002年以前, 我国主要流行的是DHAV-A,但是近几年的报道显示我国同时流行着DHAV-A和DHAV-C[10-11].本实验室前期证明, 2009年, 四川省鸭病毒性肝炎以基因C型鸭甲型肝炎为主[8].在本实验中, 我们检测了2009～2012年间四川省养鸭密集区采集312份疑似鸭肝炎样本, 检测出 120份鸭甲型肝病毒性肝炎.其中 DHAV-A阳性率为 25%, 而 DHAV-C阳性率为 75%.DHAV-C的阳性率远高于DHAV-A, 说明DHAV-C已成为我省鸭甲肝炎的优势病原, 且比例远高于我国的其他省份.这一现象应该引起我省养鸭界及有关部门的高度重视, 采取有效措施控制本病的流行.

前期大量的流行病学资料显示, DHAV-A和DHAV-C可以在同一区域同时流行[12-14], 但是并没有混合感染的报道.至2013年4月, Lin-Lin Chen等人首次报道了DHAV-A和DHAV-C混合感染雏鸭的情况[15].本文通过双重RT-PCR技术从死亡雏鸭肝脏cDNA中检测出了DHAV-A和DHAV-C, 由此确诊2013年3月, 四川省资阳市该鸭场雏鸭暴发的疾病由DHAV-A和DHAV-C混合感染所致.

在Lin-Lin Chen等人的研究中显示在中国DHAV-A和DHAV-C混合感染情况很严重, 但是在这之前未发现任何关于混合感染的报道, 可见DHAV-A和DHAV-C混合感染这种现象是新出现的并且蔓延非常迅速.在本研究中虽然检测的样本数量有限, 但是结果清楚地表明三个样本都同时感染了DHAV-A和DHAV-C, 说明我省也已经开始出现了DHAV-A和DHAV-C混合感染情况, 这给我省的养鸭界带来了重要的启示.

四川省是我国主要的养鸭区, 鸭病毒性肝炎是严重影响着养鸭业发展的重要疫病.本试验对四川省不同地区养鸭密集区采集的样本进行DHAV检测, 揭示了四川省DHAV的流行主要以DHAV-C为主, 同时首次发现了四川省出现了DHAV-A和DHAV-C混合感染的现象, 说明混合感染已经在我省开始出现, 并可能出现蔓延.这对我省养鸭区鸭病毒性肝炎的防控具有重要的意义.

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Diagnosis of simultaneously infection of duck hepatitis A virus genotype A and duck hepatitis A virus genotype C in duckling

MA Jing,TANG Cheng,YUE Hua
(College of Life Science & Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Duck virus hepatitis (DHV) is a fatal and rapidly spreading disease in young duckling.The major pathologic change in infected ducklings is hepatitis.Case of simultaneous infection of DHAV-A and DHAV-C outbreak in ducklings were reported.Twenty to twenty five day old ducklings showed about 25 to 30% morbidity and 20 to 30% mortality.The dying ducklings showed neurological symptoms and the liver of died ducklings swelling and hemorrhagic focus.The fragments of DHAV-A and DHAV-C were specific amplified by duplex RT-PCR.This is the first report on the presence of simultaneous infection of these two hepatitis virus in the ducklings in Sichuan province.In addition, the epidemiological survey of duck hepatitis A virus was investigated covering Sichuan duck concentration areas between 2009 and 2012 .120 duck hepatitis A viral hepatitis were collected from 312 clinical samples, and DHAV-C positive rate of 75%, DHAV-A was only 25%.The results illustrated the dominant pathogen was DHAV-C in Sichuan province.The presence of simultaneous infection of these two hepatitis virus were first reported in the ducklings in Sichuan province in 2013.Therefore, close attention should be paid to how to take effective measures to deal with the harm.

duck hepatitis A virus genotype A; genotype C; simultaneous infection; epidemiological investigation

S852.65

A

1003-4271(2014)02-0192-05

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.02.06

2013-11-01

岳华(1963-), 女, 教授, E-mail:yhua900@163.com.

“十二五”高技术研究发展计划项目(2012AA101304)