人类mtDNA D－Loop区位点变异对基因表达的影响

龚丽景，胡 扬，李燕春，梅 涛

目前，对于与运动能力相关分子标记的研究多采用关联分析法，但是，通过此法无法阐明分子标记对运动能力的影响机制，同时存在关联分析结果假阳性的现象。因此，通过本研究对已发现的与运动能力相关位点进行基因功能学研究，在基因表达层次上对以统计学研究基础上的结果进一步深入研究，阐明分子标记对有氧耐力影响的分子机制。

本研究命题旨在将课题组10年来发现的所有分子标记进行功能学研究，从而进一步定位与运动能力相关的分子标记。

1 前言

线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是真核生物核基因组之外的遗传物质，编码着大约22个转移RNA（tRNAs），大小2个核糖体 RNA（rRNA）和哺乳动物线粒体呼吸链中的13种疏水性蛋白质多肽［3］，在能量转换、细胞代谢等生理过程中发挥了至关重要的作用。因动物体内85%的能量产生于线粒体，线粒体的生物合成对与耐力和力量运动相关的成绩有着密切联系，并且mtDNA类型对耐力型运动员比力量型运动员的运动能力影响更大［8－9］。同时，人类线粒体的基因排列非常紧凑，任何微小的突变都有可能导致其功能区域的变化并有可能导致细胞功能的改变［4，6，15，18，20］。MtDNA的非编码区包含 D－Loop区，它的功能在于调控mtDNA的转录和复制［15］。对110名优秀长跑运动员和170名普通对照组的mtDNA全基因组解析表明，发现 D－Loop区 mt235、mt514－515、mt16183、mt16290和mt16319多态位点在运动员组和普通对照组分布频率有极显著差异（P＜0.01）。但这些差异是否影响下游基因的表达，至今未见报道。因此，本研究拟通过双荧光素酶报告基因检测方法，观察上述位点多态性对下游基因表达的影响，以探讨有氧运动能力的分子调控机理。

2 材料与方法

2.1 试剂与仪器

载体 pGL3－basic、pGL3－promoter、pRL－TK、pRL－SV40、PureYieldTMPlasmid Midiprep System、FuGENE○R6Transfection Reagent、Dual－Luciferase○RReporter Assay System 均为Promega公司产品，Fetal bovine serum（FBS）、高糖 DMEM培养基、胰蛋白酶／EDTA 消化液为Gibco公司产品，PBS（pH 7.4）、氨苄青霉素为Sigma公司产品。RNAprep Pure培养细胞／细菌总RNA提取试剂盒、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（去基因组）和SuperReal荧光定量预混试剂（SYBR Green）均购自TIANGEN公司。其他试剂为国产分析纯试剂。293T细胞为北京协和医学院病原生物学研究所惠赠。

低温高速离心机（Beckman），常温离心机（白洋），Glo Max 20／20化学发光仪 （Promega），二氧化碳培养箱（Sanyo），倒置显微镜IX70（Olympus），超净工作台（上海博讯），实时荧光定量PCR仪（ABI 7500），NanoDrop超微量分光光度计（Thermo）等。

2.2 实验方法

2.2.1 质粒构建

根据SNPs序列信息，在线粒体基因剑桥序列找到mtDNA的D－Loop区序列［12］，采用全基因组合成方法合成含 mt235、mt514－515、mt16183、mt16290和 mt16319位点的基因片段，片段序列见表1。由上海捷瑞生物工程有限公司合成所需的5对目的片段，并连接至pGL3－Promoter载体。

将所得质粒甘油菌扩大摇菌16h后，用Promega无内毒素质粒中提试剂盒提取质粒，再用NanoDrop分光光度计测定各质粒在260、280和230nm波长下的吸光度值，以计算其浓度、A260／A280和A260／A230的比值。

2.2.2 细胞转染

293T细胞使用含10%FBS的高糖DMEM培养基培养。转染前一天293T细胞长满至培养瓶底的80%，用胰酶消化分离成单细胞，计数细胞，再用不含抗生素的DMEM培养基稀释细胞至细胞密度为3×105个／ml，向24孔板中加入0.5ml／孔细胞悬液。培养24h后细胞生长至60%～70%，配制转染混合物，Promega FuGENE○R6转染试剂与质粒DNA的按照3：1的比例混合［13］，步骤按说明书进行。24孔板加入25μl／孔转染混合物，摇匀后继续培养24h。因研究时间不同，mt235、mt514－515和mt16183位点质粒转染时采用海肾荧光素酶质粒pRLSV40为共转染质粒（构建质粒：共转染质粒＝10∶1），mt16290和mt16319位点质粒采用pRL－TK为共转染质粒（构建质粒：共转染质粒＝20：1）。质粒pGL3－basic为对照组，质粒pGL3－promoter为阳性对照组，所有质粒转染均做3孔平行。

2.2.3 荧光素酶相对活性检测

转染后细胞的荧光素酶活性使用Promega公司的Dual－Luciferase○RReporter Assay System 试剂盒，在 Glo Max 20／20化学发光仪进行萤火虫荧光素酶活性（F值）和海肾荧光素酶活性（R值）的检测。每个孔检测3次。

2.2.4 荧光素酶mRNA的表达

采用实时荧光定量PCR检测质粒转染后细胞内荧光素mRNA的表达。在GenBank数据库查找pGL3－Promoter基因序列（U47298.2），基因总长5010bp，其中CDS区在280～1932bp之间。内参基因选用GAPDH基因（NCBI RefSeq：NC＿000012.11），全长3953bp。使用Primer Premier 5设计荧光素酶的引物（在CDS区），GAPDH引物参考RTPrimerDB数据库［14］，具体见表2。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 本研究目的基因的合成片段序列一览表Table 1 The Synthesized Sequences of Target Gene

表2 本研究荧光素酶基因和内参基因引物一览表Table 2 The Primers of the Luciferase Gene and GAPDH Gene

所有质粒转染293T细胞24h，pRL－TK为共转染质粒（构建质粒：共转染质粒＝20∶1）。使用RNAprep Pure培养细胞总RNA提取试剂盒提取转染细胞总RNA，测定OD230、OD260和 OD280，计算浓度和纯度，1.5%琼脂糖凝胶电泳查看纯度，使用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（去基因组）反转录成cDNA，再用SuperReal荧光定量预混试剂（含SYBR Green I）做实时荧光qPCR，模板为1μl cDNA于20μl反应体系中，操作按照说明书完成。两步法反应程序是：95℃预变性15min；95℃10s→60℃32s，共40个循环；最后自动添加融解曲线，条件为95℃15s→60℃1min→95℃15s。

2.2.5 统计学分析

荧光素酶报告基因检测结果以萤火虫荧光素酶发光值／海肾荧光素酶发光值为表达活性（F／R），数据均以±SD表示，各组间比较采用单因素方差（ANOVA）分析；实时荧光定量PCR结果以2－ΔΔct来表示，以±SD表示，组间比较采用t检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同质粒转染细胞荧光素酶报告基因相对活性结果

经过检测，所提取的质粒浓度为378.69±51.95ng／μl，OD260／280为1.92±0.005，大于1.8，说明样本不含酚或者蛋白质；OD260／230为2.11±0.02，大于2.0，说明样本没有残存盐或者小分子杂质污染，所提取的质粒纯度高，可以用于细胞转染。质粒转染细胞24h后检测荧光素酶活性，计算F／R活性比值。单因素方差分析F／R结果如图1显示。与各自pGL3－basic相比，pGL3－mt235A、 pGL3－514－515CA、 pGL3－mt16183A、 pGL3－mt16290C、pGL3－mt16290T、pGL3－mt16319G 和 pGL3－mt16319A质粒转染后细胞的荧光素酶活性都极显著升高（P＜0.01）。相反，pGL3－mt235G、pGL3－514－515Del和pGL3－mt16183C质粒转染后F／R比pGL3－basic有极显著降低（P＜0.01）。与各自pGL3－Promoter质粒相比，pGL3－514－515CA、pGL3－mt16183A、pGL3－mt16290C 和 pGL3－mt16290T极显著升高 （P＜0.01），但 pGL3－mt235A、pGL3－mt16319G 和 pGL3－mt16319A 的 F／R 值比 pGL3－Promoter质粒下降。

用独立样本t检验分析携带同位点不同基因型的质粒，发现pGL3－mt235A、pGL3－514－515CA、pGL3－mt16183A和pGL3－mt16319G转染后细胞荧光素酶相对活性显著高于 pGL3－mt235G、pGL3－514－515Del、pGL3－mt16183C 和pGL3－mt16319A（P＜0.01）。但pGL3－mt16290C和 T质粒转染后荧光素酶活性之间没有差别。

3.2 不同质粒转染细胞荧光素酶mRNA表达结果

质粒转染后提取细胞总RNA的浓度为71.91±6.14 μg／ml，OD260／280为2.09±0.01，OD260／230为2.2±0.06，说明纯度和浓度都较高，可以用于后续研究。采用相对定量PCR法，检测各组质粒转染细胞的目的基因和内参基因Ct值，进而计算2－ΔΔct来显示荧光素酶mRNA表达结果，如表3及图2所示。单因素方差分析结果，pGL3－mt235A、pGL3－mt235C、pGL3－514－515CA、pGL3－514－515Del、pGL3－mt16183A 和 pGL3－mt16319G 转染 后细胞的荧光素酶mRNA表达比pGL3－basic的有极显著升高（P＜0.01），pGL3－mt16290C 和 pGL3－mt16319G 升高显著（P＜0.05）。而 pGL3－Promoter、pGL3－mt16183C 和pGL3－mt16290T较pGL3－basic转染后的荧光素酶 mRNA高却没有显著差别，但pGL3－mt16319A极显著降低（P＜0.01）。 与 pGL3－Promoter 质粒相比，pGL3－mt235A、pGL3－mt235C、 pGL3－514－515CA、 pGL3－514－515Del、pGL3－mt16183A有极显著升高（P＜0.01）。

用独立样本t检验分析发现，pGL3－mt235A、pGL3－mt16183A 和 pGL3－mt16319G 较 pGL3－mt235G、pGL3－mt16183C和pGL3－mt16319A质粒转染细胞后荧光素酶mRNA显著性高（P＜0.01），pGL3－514－515CA 比 pGL3－514－515Del的也有显著性提高（P＜0.05）。但是，pGL3－mt16290C和pGL3－mt16290T质粒转染后荧光素酶mRNA之间没有差别。

图1 本研究不同基因型质粒转染293T细胞24h后的相对荧光素酶活性F／R的比较柱状图Figure 1. The Relative Luciferase Activity F／R in Cell Transfected by Different Genotypes after 24h

表3 本研究各基因型质粒转染细胞荧光素酶mRNA相对表达量比较一览表Table 3 The Luciferase mRNA Expression in Cells Transfected by Different Genotypes Plasmids

4 讨论

4.1 mtDNA非编码区位点变异对荧光素酶相对活性的影响

mtDNA的控制区（Control Region，包括 Displacement Loop，简称D－Loop区），包括 H链的启动子（HSP）、L链启动子（LSP）、H链复制子 Oh、保守序列节段（Conserved sequence block，CSB）及L链上的终止结合序列（TAS）。线粒体mRNA从单一位点转录，即所有tRNA，rRNA，mRNA均由同一顺反子转录而来［11］。mtDNA的转录从HSP和LSP两处开始，转录因子（mtTF1）与LSP、HSP起点特异性结合，激活转录酶，转录开始后产生一个多顺反子，其中包括mRNA和散在分布其中的tRNA，剪切位点多在tRNA处，从而分离释放出 mRNA、tRNA［21］。D－Loop区是 mtDNA的非编码区之一，它的功能在于调控mtDNA的转录和复制。本研究中的5个位点位于D－Loop区内不同的功能区。mt235位于mtDNA的CSB1区［7］和mtTF1binding site（TFX）［10］，是这两个区共有的位点。 研究结果显示，pGL3－235A的F／R极显著高于pGL3－235G的质粒转染结果，说明mt235A的对下游基因的表达作用强于mt235G。mt514－515位点位于D－Loop区的高变区3（Hypervariable segment3，HV3），两个位点完全连锁（r＝1.0）。研究结果显示，pGL3－514－515CA 的 F／R 极显著高于pGL3－514－515Del的，说明 mt514－515CA对基因表达的作用强于 mt514－515Del 的作用。mt16183、mt16290、mt16319位点均位于D－Loop区的7SDNA上［2］。从报告基因的 F／R值看，pGL3－16183A 和 pGL3－16319G分别极显著高于pGL3－16183C和pGL3－16319A，说明 mt16183A和mt16319G具有上调基因表达的作用。而pGL3－16290C和pGL3－16290T的F／R没有差别，推测该位点变异可能对基因表达没有影响。

图2 本研究各质粒转染细胞荧光素酶mRNA相对表达量比较柱状图Figure2.The Luciferase mRNA Expression in Cells Transfected by Different Genotypes Plasmid

4.2 mtDNA非编码区位点变异对报告基因mRNA表达的影响

近年来，通过基因多态性与长寿、疾病、运动能力等的关联研究发现［1，5，19］，线粒体基因突变与生命现象有紧密关联。比如，mtDNA的突变和减少被认为是癌症发生的因素。通过结肠直肠癌细胞HCT－8的mtDNA和ATP含量显著下降，同时伴随mtDNA编码的mRNAs减少的研究，细胞对抗癌药的敏感性下降和蓄积，产生HCT－8细胞的多重耐药性（MDR）表型，同时发现mtDNA减少的细胞的MDR1mRNA及其翻译产物P糖蛋白的上升是由于RNA稳定性增加，而不是转录激活［16］。通过构建结肠直肠癌细胞SW480线粒体D－loop区的真核表达载体并转染至NIH3T3细胞，发现NIH3T3／SW480细胞的生长率和集群率显著升高，细胞凋亡率下降，同时在NIH3T3／SW480细胞发现多倍的和畸形的染色体，说明结肠直肠癌细胞的mtDNA会提高NIH3T3细胞的恶性表型，并建议对NIH3T3／SW480细胞的生物功能做研究，进一步解释mtDNA在结肠直肠癌中的作用［17］。

线粒体基因调控和编码的基因（如ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6，COX1和 COX2，ATP6、ATP8等）对有氧运动有着极为密切的联系，但是，mtDNA位点突变对运动能力的关联研究不多，进一步对生物功能的研究更少。在前期研究mtDNA多态性与有氧运动能力的关联分析获得5个阳性位点，研究这些位点的生物功能的同时，为了检验mtDNA对报告基因的转录水平影响，进行转染后细胞的荧光素酶mRNA水平检测。对每个位点进行独立样本t检验分析，发现pGL3－235A质粒转染后细胞中报告基因mRNA表达极显著高于pGL3－235G的，pGL3－16183A的极显著高于 pGL3－16183C，同样 pGL3－16319G的 mRNA表达极显著高于pGL3－16319A，P＜0.01，与报告基因相对活性 F／R结果一致。pGL3－514－515CA显著高于 pGL3－514－515Del（P＜0.05），基本与F／R结果（P＜0.01）相符合。报告基因的相对活性和mRNA 表达结果一致，表明 mt235A、mt514－515CA、mt16183A和mt16319G对下游基因的转录和翻译均有上调作用，而 mt235G、mt514－515Del、mt16183C 对下游基因表达低于 mt235A、mt514－515CA、mt16183A 的调节作用，mt16319A甚至下调下游基因的表达。pGL3－16290C与pGL3－16290T之间没有显著性差异，这与报告基因相对活性F／R的结果一致，说明mt16290位点变异对基因转录和翻译没有差别影响。

5 小结

根据优秀运动员和普通人对比筛选出来的5个mtDNA阳性多态位点，本研究通过生物功能研究，发现mt235A、mt514－515CA、mt16183A和 mt16319G可以上调报告基因的转录和翻译，推断可能对耐力运动员的运动能力表型产生影响；而mt16290位点变异对基因表达没有区别影响。

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