基于UPLC-TOF-MS研究冰片对丹参酮ⅡA在大鼠体内药代动力学的影响

张璠璠，王宇光，梁乾德，马增春，汤响林，谭洪玲，肖成荣，赵永红，高 月

（1.中南大学研究生院，湖南长沙 410000；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850）

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参的干燥根及根茎。丹参性苦，微寒；归心、肝经。首载于《神农本草经》，被列为上品，称其“主心腹邪气，破散除瘕，止烦满”，为治疗心血管疾病的良药［1］。临床上常用于治疗月经不调，经闭痛经，瘕积聚，肝脾肿大，心绞痛等疾病［2］。丹参酮ⅡA（tanshinoneⅡA，TS）是从丹参的根中提取分离的二萜醌类化合物，为丹参中的有效成分，具有多种药理活性，如抗菌、抗氧化、扩张冠状动脉、增加心肌血流量等功效［3］。复方丹参方是活血化瘀、芳香开窍、理气止痛的名方，临床上常用于治疗心血管疾病，本研究选择复方丹参方中使药冰片和君药丹参作为研究对象。进一步研究冰片对丹参体内过程的影响，特别是对主要成分丹参酮ⅡA的体内过程影响，有助于探究中药复方配伍增效的科学性。目前研究多集中于冰片与丹参中水溶性成分的配伍，但脂溶性成分丹参酮ⅡA较少研究，但丹参酮ⅡA是丹参中丹参脂溶性成分含量最大的有效活性成分［4］，也是发挥药效的重要成分，因此有必要研究冰片对丹参酮ⅡA体内过程的影响，为研究复方丹参方配伍组方的合理性提供体内过程的证据。

冰片是中医药中常用的佐药，具有开窍醒神、清热止痛、生肌之效。为小分子脂溶性单萜类物质。《本草纲目》言其能“通诸窍”。作为药引，冰片在许多方剂中起到增加其他药物的治疗效果，即所谓的“芳香走窜，引药上行”，“独行则势弱，佐使则有功”的作用。已有研究显示，冰片与其他药物配伍可以提高药物的生物利用度、促进开放血脑屏障、增加药物在组织中的分布等［5-7］，目前研究冰片与丹参中水溶性成分的配伍较多，但是冰片与脂溶性成分丹参酮IIA的配伍却未见报道。本文建立了超高效液相色谱（UPLC）检测大鼠血浆中丹参酮ⅡA的分析方法，进一步检测并分析了两者配伍前后对丹参酮ⅡA药代动力学行为的影响，以阐明冰片对丹参酮ⅡA药代动力学的改变与复方丹参方配伍合理性的关系。

丹参酮ⅡA，冰片以及内标物苦杏仁苷的结构式如下：

1 材料

1.1 仪器 Acquity UPLC-Synapt MS色谱-质谱联用仪（Water公司）、Acquity CSHTMC18色谱柱（100 mm×2.1 mm I.D，1.7μm，Waters公司）、MassLynx V4.1质谱工作站（Water公司）、纯水仪（Millipore Simplicity）、冷冻离心机（Heraeus Labofuge 400R）

1.2 药品与试剂 丹参酮ⅡA标准品（中国食品药品检定研究院，批号110766-200619）、冰片（购于安徽绿源公司，经军事医学科学院放射医学研究所马百平教授鉴定）、乙腈（色谱纯，Fisher Scientific公司）、甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、肝素钠（江苏万邦生化医药股份有限公司，批号1207106）。

1.3 动物 SD大鼠♂，体质量（220～250）g，北京维通利华实验动物公司提供，许可证号SCXK-（京）-2012-0001。

2 方法

2.1 色谱与质谱条件 采用电喷雾电离离子源（ESI），正离子 V模式检测：m／z范围为70-1000，毛细管电压为2.9 kV，锥孔电压为40 kV，离子源温度为100℃，脱溶剂温为450℃，脱溶剂气体流速为900 L·h-1，锥孔气流量为50 L·h-1，质量校正质核比为556.2771［8］。流动相为A相0.10%甲酸水溶液，B相为0.10%甲酸乙腈溶液；流速0.40 ml·min-1，柱温40℃；进样量为8μl。

2.2 对照品溶液制备 精密称定丹参酮ⅡA对照品5 mg，甲醇溶解于50 ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，制备成100 mg·L-1对照品储存溶液。

2.3 血浆样品制备 取大鼠全血，4 000 r·min-1离心10 min，取上清100μl，加入内标溶液（0.1 mg·L-1苦杏仁苷），混匀，加入乙腈300μl，涡流震荡10 min，离心 10 min（13 000 r·min-1），取上清 200 μl。

2.4 动物手术 SD大鼠实验前进行右颈静脉插管手术，大鼠麻醉后，剃毛，暴露右颈术野，作一5 mm切口。钝性分离出右颈静脉，结扎远心端后作一小切口，插入PE管后结扎固定，导管经颈背部皮下穿出。确保血流通畅后，固定于后背上。术后恢复用于实验。

2.5 标曲溶液的配制 取大鼠空白血浆100μl，加入丹参酮ⅡA系列标准溶液20μl，配制成相当于浓度为 0.06、0.02、0.01、0.008、0.004、0.002和 0.001 mg·L-1的血浆样品，按照上述“2.3”项下操作。

2.6 回收率、精密度和稳定性溶液的配制 精密加入空白大鼠血浆100μl及不同质量浓度丹参酮ⅡA对照品，溶液置EP管中，涡旋混合，配制成高、中、低（0.04、0.02、0.01 mg·L-1）3个质量浓度的血浆样品，按“2.3”项下方法制备样品。

3 结果

3.1 方法学专属性 取空白血浆和空白血浆加丹参酮ⅡA对照品溶液，按照分析方法和色谱条件，进样，得出选择离子流图见Fig 1，经比较，空白血浆中的杂质不干扰丹参酮ⅡA的测定，可以用来定量分析。

3.2 标准曲线 以血浆中待测物浓度（C）为横坐标，待测物与内标物的峰面积之比（Y）为纵坐标，回归方程为＾Y＝0.5127C-0.0001，r＝0.999，n＝7，丹参酮ⅡA的线性范围为0.001～0.06 mg·L-1。

3.3 回收率及精密度实验 平行操作4次，高、中、低平均方法回收率为108.0%、106.5%、101.6%。处理后的样品置于冰箱中保存，于1 d内进样，计算高、中、低日内精密度 RSD分别为4.9%，8.0%，5.3%，连续4 d，每天每个浓度进样1次，计算高、中、低日间精密度分别为3.7%、3.3%、4.6%。

3.4 稳定性实验 分别考察样品在室温条件下放置12、36h，以及-20℃冷冻放置4d期间反复冻融3次的稳定性。结果 RSD分别为：3.7%、1.3%、6.0%，表示稳定性良好。

3.5 丹参酮ⅡA在大鼠血浆中药物浓度测定结果SD大鼠20只，按体重随机分为4组，每组5只，实验前禁食 12 h，不禁水，于给药后 5、10、15、20、30、45、60、120、180、240、360、720、1440 min从右颈静脉取血500μl，并同时补充相等体积的生理盐水，置肝素钠处理后的离心管中，按“2.3”项下处理、分析。测得平均血药浓度-时间曲线，见Fig 2、3、4。采用DAS软件计算大鼠单次口服丹参酮IIA的药动学参数，结果见Tab 1。

Fig 1 Representative selected reaction monitoring（SRM）chromatograms of plasma sample determined bypresent UPLC-TOF-MS methodA：Blank plasma sample；B：Blank plasma sample spiked with 0.04 mg·L-1 tanshinoneⅡA（Ⅱ）and internal standard（Ⅰ）；C：Plasma sample withrawn at 0.25 h after oral administration 0f TSIIA at a dose of 15 mg·L-1 to a SD rat；Ⅰ ＝Amygdalin，Ⅱ ＝tanshinoneⅡA.

Tab 1 Main pharmacokinetic parameters after oral administration of TsIIA with 0，15，30，and 60 mg·kg-1 borneol in rats¯x±s，n＝8）

Tab 1 Main pharmacokinetic parameters after oral administration of TsIIA with 0，15，30，and 60 mg·kg-1 borneol in rats¯x±s，n＝8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（given TsIIA alone）

eters TanshinoneⅡA borneol（0-t） 5.502±1.126 16.141±3.438** 7.895±1.408**0 mg·kg-1 borneol 15 mg·kg-1 borneol 30 mg·kg-1 borneol 60 mg·kg-1 7.508±1.784 AUC（0-∞） 5.97±1.65 16.8±3.799** 8.394±1.747 7.565±1.786 C max 0.009±0.001 0.039±0.004** 0.013±0.002** 0.012±0.002*MRT（0-t） 459.296±81.337 470.666±88.788 460.352±67.805 443.052±68.571 T max 312±107.331 15±0** 228±130 253.333±165.731 CLz 2647.631±618.316 934.916±249.994** 1865.021±474.349 2098.911±605.837 T1 2 z 308.773±139.763 283.81±92.252 286.012±136.173 192.547±23.12 Vz 1089165.7±283857 361684.62±65778.83** 729473.82±273982.76 583963.22±186964.37*

4 讨论

药物的配伍在临床合理用药方面有十分重要的意义，对于中药复方进行体内成分间相互作用及其与增效的关系十分必要。本研究采用的超高效液相色谱／四级杆飞行时间质谱联用技术，具有超高压、超高灵敏度、超高分离度、高选择性等特点，是一种较好的定性定量方法，为目前分析中药复杂系统有力的工具之一［9-11］。通过研究冰片对丹参酮IIA体内过程的影响来阐述二者的配伍增效规律，为临床用药和组方提供实验依据。Tab 1和Fig 2、3、4中所列，和单独口服丹参酮IIA相比，在口服15、30、60 mg·kg-1的冰片后丹参酮ⅡA的 AUC（0-T）和 Cmax明显提高，提示冰片增加了丹参酮IIA的口服吸收，显示了冰片在复方丹参方配伍增效中扮演重要角色，有助于解释组方的合理性和科学性。这也为其他中药复方的配伍提供借鉴和参考。

研究表明，冰片能促进药物透过血脑屏障、黏膜、皮肤等［12］，主要与其通过影响神经递质的含量，影响P-糖蛋白的表达，升高一氧化氮（NO）的含量有关，冰片对药物代谢酶的影响也很大［13］，进而影响其他药物的吸收，并进一步改变其在体内代谢行为，提高其他药物的生物利用度，产生复方成分间增效的相互作用。已有的研究显示冰片具有一定的毒性，如何在发挥冰片增效的同时尽量避免冰片出现毒性反应，就要对冰片在组方中用量进行科学研究，本次研究显示小剂量15 mg·kg-1时对丹参酮ⅡA具有明显的增强其生物利用度的作用，更高剂量冰片反而对丹参酮ⅡA的增效作用没有小剂量明显，因此促进丹参的生物利用度的同时，尽量减少或降低冰片的用量，对于复方的有效性和安全性更有意义。

本研究显示丹参酮ⅡA在大鼠体内的药时曲线呈现不规则的多峰现象，可能与肝肠循环、多部位吸收、药物在组织分布后的再吸收、药物制剂的因素、个体差异、血流动力学等因素有关。造成多峰原因可能是一个或多个因素综合作用的结果［14-15］，这些需要进行组织分布实验和通过考察肝肠循环现象来确证等。

综上，本文比较了正常大鼠单独给予丹参酮ⅡA和与冰片配伍后给药，丹参酮ⅡA的体内过程，二者均符合非房室模型。丹参酮ⅡA和冰片配伍后，与丹参酮ⅡA单独给药比较，丹参酮ⅡA的最高血药浓度（Cmax）增大，药-时曲线面积（AUC）明显增加。提示冰片可促进丹参酮ⅡA的吸收，提高其生物利用度。特别是在冰片低剂量时效果更加明显，显示出冰片增丹参之效的配伍特点。

Fig 2 Plasma concentration-time curve of rats after oral administration of TsIIA with 0，15 mg·kg-1 borneol（±s，n＝5）

Fig 3 Plasma concentration-time curve of rats after oral administration of TsIIA with 0，30 mg·kg-1 borneol（±s，n＝5）

Fig 4 Plasma concentration-time curve of rats after oral administration of TsIIA with 0，60 mg·kg-1 borneol（±s，n＝5）

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