两色金鸡菊醇提物对自发性高血压大鼠尿液的代谢组学研究

卢 伟，马晓丽，兰 怡，李琳琳，王 烨，靳春丽，毛新民，4

（新疆医科大学1.基础学院药理学教研室、2.分析测试中心、3.附属中医院、4.中医学院，新疆乌鲁木齐 830011）

代谢组学是近年来新兴的一门学科［1-2］，可以从整体水平上研究生物体受外界环境搅动后，体内小分子物质的变化。作为系统生物学的重要组成部分，它已被广泛应用于药物毒性分析、新药筛选及复杂疾病的作用机制研究。高血压病是一种整合遗传因素和环境因素（钠盐、酒精过量和肥胖）的复杂疾病，尤其具有家族聚集性［3-5］，目前对其研究表明，其发生与糖代谢、脂代谢及氨基酸等小分子代谢紊乱有密切关系［6］。

两色金鸡菊（Coreopsis tinctoria Nutt.），又称“昆仑雪菊”［7］，属菊科（Compositae）金鸡菊属（Coreopsis）一年生草本植物。研究表明将其当茶饮用，具有降血压、降血脂、降血糖的功效［8］。但其具体的作用机制尚不明确。本研究工作尝试建立一种两色金鸡菊醇提物对自发性高血压大鼠代谢干预的代谢组学评价方法，采用NMR分析方法测定给药组和对照组大鼠的尿样，得到尿样中小分子代谢物的图谱，结合主成分分析（P-LS-DA）方法，考察小分子内源性代谢物受金鸡菊醇提物灌胃影响而产生的变化，探讨金鸡菊提取物长期给药后，高血压大鼠尿液代谢物的变化。

1 材料

1.1 动物 ♂自发性高血压大鼠（SHR），40只，北京维通利华实验动物技术有限公司；♂ Wistar大鼠，8只，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2012-0001；饲养环境光照12 h/天，温度（21±2）℃，湿度45%～55%。

1.2 药物及试剂 新疆两色金鸡菊醇提物中试冻干粉（乌鲁木齐三高和药业有限公司提供，批号：20121217）。卡托普利片（中美上海施贵宝制药有限公司，批号：1211031）；杜仲平压片（贵州三仁堂药业有限公司，批号：20121206）；重水（Cambridge I-sotope Laboratories， Inc产 品 ）；NaCl、K2HPO4、NaH2PO4（天津市光复精细化工研究所 ），TSP，核磁管，蒸馏水。

1.3 试剂和仪器 BP-98A无创血压计（北京软隆生物技术有限公司）；TDL-5M型大容量低温离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KDC-2046型低温离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；AB204-N型分析天平（梅特勒-托勒德）；电子天平（中山市衡新电子有限公司）；Inova 600型核磁共振波谱仪（美国Varian公司）。

2 方法

2.1 分组及给药 将11周龄的SHR大鼠适应性喂养1周后，连续2 d测量大鼠血压，将2 d的血压取均值，然后，按照大鼠血压值均衡随机分为6组，分别为：模型组（6只）、杜仲片组（6只，187.5 mg·kg-1）、卡托普利组（7只，4 mg·kg-1）、两色金鸡菊醇提物低剂量组（7只，0.8 g·kg-1）、中剂量组（7只，1.6 g·kg-1）、高剂量组（7只，3.2 g·kg-1），8只Wistar大鼠为空白组。各组喂食普通饲料，自由进水。各组大鼠每天灌胃1次，灌胃容积为10 ml·kg-1。连续灌胃给药4周。

2.2 血压测定 每5 d采用BP-98A无创血压计测量血压1次。操作时，先将大鼠装进保温套中，加热5 min左右，连续测量5～6次，取收缩压（SBP）平均值为该大鼠的血压值。

2.3 尿液收集和处理 采用代谢笼，分别于造模后 1、2、3、4周末，收集大鼠夜间 12 h尿液，置于-20℃冰箱保存，备用。NMR分析前，尿样解冻至室温，12 000 r·min-1离心 10 min，取出上清液，装入干净的EP管中，每个尿液样本各取400μl，每个样本加入200μl重水配制的磷酸缓冲液中，室温放置 10 min，，以 10 000 r·min-1离心 10 min，取上清液550μl，放入5 mm核磁管中进行NMR测试。

2.4 NMR条件 尿液1H核磁共振图谱（1H-NMR谱）：采用Inova600型核磁共振波谱仪调用NOESYPRESAT-1D（RD-90○-t1-90○-tm-90○-ACQ）脉冲序列进行氢谱测定。NMR条件：对1H核共振频率为500.13 MHz，累积扫描64次，采样数据点32 768，谱宽 20 mg·L-1，采样延迟 2 s，每次扫描时间均为1.64 s，测试温度25℃，采用预饱和方法压制水峰。

2.5 数据分析 进行基线及相位调整后，选择H为10.0～0.5ppm的区域进行自动积分，积分区间设为0.003 ppm。为了消除饮水量对代谢物浓度的影响，积分值进行归一化处理（每一段积分值除于所有积分值之和），并用SMICA-P＋（瑞士）软件进行最小方差判别分析法（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）进行统计分析和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）。

3 结果

3.1 SHR大鼠SBP的变化 给药前，与空白组相比，模型组血压明显高于空白组（P＜0.01）；而其他各组大鼠血压与模型组差异均无统计学意义（P＞0.05）。干预1周后，与模型组相比，卡托普利组、两色金鸡菊醇提物中、高剂量组大鼠血压较模型组有明显下降，具有统计学意义（P＜0.01）。干预2周后，阳性药卡托普利组、两色金鸡菊醇提物中、高剂量组中大鼠血压较模型组有明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）；阳性药杜仲片组血压也有下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。从第3周开始到实验结束，各干预组大鼠血压持续下降，与模型组相比均有明显下降（P＜0.01），而在实验期间，模型组大鼠血压持续稳定在一定水平。实验结果表明，两色金鸡菊具有较好的降低SHR大鼠血压的作用。见Tab 1。

3.2 SHR大鼠尿液代谢物图谱分析 应用NMR技术获得了各组给药大鼠及模型组大鼠的尿液代谢谱，根据位移值分析出15种代谢物质（Fig 1）。由于肉眼无法对不同组别见代谢物进行差异比较，因此选取了多元统计分析中的PLS-DA，分析两色金鸡菊是否对高血压大鼠的代谢产生影响。Fig 2提供了给药第3周各组大鼠尿液代谢产物的偏最小分析得分图。从Fig 2可见，SHR模型组与阳性药物组以及两色金鸡菊给药组存在一定的代谢差异。阳性药物杜仲降压片的代谢模式较正常与模型组均较远，可能该药物对尿液的代谢影响不大；两色金鸡菊各给药组的代谢模式较为规律，从小剂量组到大剂量组依次向正常组靠近，大剂量组最接近正常组的代谢模式，说明大剂量组的治疗效果最好，与阳性药卡托普利组相似，提示两色金鸡菊组确有一定的疗效，其作用也许并非通过直接降低血压来实现，而是使失衡的代谢由疾病状态恢复到正常状态。

3.3 两色金鸡菊对SHR大鼠尿液代谢产物的影响Fig 3提供了两色金鸡菊大剂量组大鼠与SHR模型组大鼠尿液代谢产物的载荷图。根据模型的拟合程度得到 R2X＝0.957，R2Y ＝0.544，Q2＝0.479，说明这个模型具有很好的拟合效果和良好的预测能力。图中离中心越远的点即为代谢差异物质，这些物质可能是潜在的生物标志物。将差异具有统计学意义（P＜0.05）的物质列于Tab 2。由Tab 2知，两色金鸡菊大剂量组处理后的大鼠尿液中有多种成分较模型组差异有显著性，包括异亮氨酸、肌酸酐、葡萄糖等多种代谢产物，这些代谢物可能与两色金鸡菊治疗高血压的作用机制有关。

Tab 1 Change of SBP during experiments（±s）

Tab 1 Change of SBP during experiments（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group；＃＃P＜0.01 vs normal group

Group n 4 weeks Normal 8 127±2.7 127±5.3 126±5.7 127±4.1 125±BP/mmHg Before feeding with drug 1 weeks 2 weeks 3 weeks 4.4 Model 6 193±6.7＃＃ 191±4.1＃＃ 190±4.4＃＃ 190±4.5＃＃ 190±3.9＃＃Duzhong 6 192±6.8 186±3.9* 182±5.2* 174±4.4** 174±4.6**Captopril 7 190±8.6 175±2.3** 166±7.2** 155±6.1** 152±4.7**Low dosage 6 190±8.4 189±5.1 183±6.3 175±3.8** 174±5.5**Middle dosage 7 191±9.5 181±4.0** 176±5.4** 163±7.0** 160±5.7**High dosage 7 190±6.6 176±2.7** 171±5.7** 160±5.9** 159±6.0**

Fig 1 The NMR graph of the urine samples from rats1：Isoleucine；2：Citric acid；3：Scyllo inositol；4：Creatinine；5：Hippuric acid；6：Creatine；7：β-glucose；8：Acetone；9：Acetic acid；10：α-Ketoglutaric acid；11：Malic acid；12：Taurine；13：Choline；14：Allantoin；15：Dimethylamine

Fig 2 3D score p lots of the rats urine sam p les from different groupsnormal group； model group；captopril group；Duzhong tablets group； low dosage of extracts of Coreopsis tinctoria Nutt；middle dosage of Coreopsis tinctoria Nutt；high dosage of Coreopsis tinctoria Nutt.

Fig 3 Loading p lots of principal com ponent

Tab 2 Change ofmetabolics of SHR rats

4 讨论

SHR作为一种遗传性、自发性高血压模型，是最能模拟人类高血压的发生、发展过程的动物模型。本次试验在对各组大鼠适应性喂食1周后测定血压，发现模型组大鼠血压较正常Wistar大鼠明显升高，连续观察4周发现模型组与正常对照组大鼠的血压非常稳定，适于药物干预观察疗效。试验选取了西药卡托普利和中药杜仲降压片作为阳性药物，对比观察两色金鸡菊不同剂量醇提物对SHR大鼠血压及其生化指标的影响。两色金鸡菊不同剂量组给药4周后，动物血压明显降低，效果与两种阳性药物相似，说明其可以从整体水平上降低大鼠血压。进一步应用代谢组学技术研究高血压大鼠代谢产物的变化，通过代谢产物的变化，研究药物对高血压大鼠的作用及可能的作用机制。

实验结果发现，高血压模型组与两色金鸡菊各剂量组具有较为清晰的代谢轮廓分布。阳性药物卡托普利的代谢物远离模型组大鼠的尿液代谢区域，而两色金鸡菊各剂量组的代谢分布也随着剂量增加逐渐向正常组靠近，尤其大剂量组与卡托普利组非常接近，说明两色金鸡菊大剂量组与卡托普利治疗高血压的作用效果相似。为了更为准确地观察两色金鸡菊对高血压大鼠代谢物的影响，选取模型组与大剂量组大鼠尿液样品进行PLS-DA的代谢模式比较，找出代谢差异变量。

从两色金鸡菊大剂量组与模型组尿液样品的NMR谱及PLS-DA结果，发现多种代谢产物与高血压病症密切相关，与糖代谢相关的代谢物如β-葡萄糖、苹果酸、丙酮也在本次试验被发现，如上述糖代谢物质在模型组中均明显升高，说明高血压大鼠在血压处于高值的同时还伴有葡萄糖代谢异常；另外，一些与肠道菌群有关的小分子物质如胆碱、肌酸酐等也可能作为高血压的标志物。这些内源性成分的改变提示模型组大鼠尿液存在相关代谢功能的异常，而经过药物干预后，这些指标性成分会得到改善。

综上所述，代谢组学可以从整体水平反映疾病治疗过程中的小分子代谢变化，可与机体在药物干预下发生的病理生理变化联系起来，有助于更全面地阐述药物的治疗效果及分析作用机制。本研究通过观察SHR大鼠尿液中的代谢产物变化，进一步了解到两色金鸡菊减低SHR大鼠血压可能与氨基酸代谢、糖代谢及小分子代谢通路有关。今后，还需要与蛋白组学等联合分析，才能深入了解两色金鸡菊对高血压作用的详细机制。

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