肉桂单宁的提取工艺比较研究

陈荟芸，马 丽，赖 芳，李伟光，刘珈伶，刘雄民

（广西大学化学化工学院，广西南宁530004）

单宁，又称鞣质，是一种广泛存在于植物根、茎、叶、果实及树皮等部位的复杂酚类化合物[1]。单宁独特的化学性质和多元酚结构使其在延缓衰老、预防和治疗由自由基引起的疾病如肿瘤、癌变、心脑血管疾病等方面显示出独特的优越性[2]，在临床医学、食品、化妆品等领域得到广泛的关注和应用[3]。

肉桂（cinnamon cortex）是樟科樟属植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥树皮[4]，是我国药食两用的植物资源。肉桂含挥发油[5]、黄酮[6]、多酚[7]、多糖[8]、皂苷[9]等多种成分，近年来，在对这些有效成分的提取、成分分析和药理活性研究方面取得了不少进展[10-15]。

目前，关于肉桂多酚的研究较多[16-18]，而针对肉桂单宁的则较少。已见报道的肉桂单宁类化合物的定量方法有Folin-Denis法[19]和酸化香草醛法[20]。但Folin-Denis法一般用于测定总酚含量，对单宁的测定并无特异性，测定缩合单宁带来较大误差。酸化香草醛法是测定缩合单宁含量常用的方法，其酸性催化介质一般为盐酸或硫酸，有研究[21]表明以硫酸为催化介质测定单宁含量时准确性和重现性均优于盐酸。超声提取具有提取温度低、效率高、节能省时等优势，已广泛用于多种植物单宁的提取，但其应用于肉桂单宁的提取却未见报道。

本文以广西肉桂为原料，采用溶剂法和超声辅助法对肉桂单宁提取工艺进行比较研究，建立了以儿茶素为标准品，香草醛-硫酸为显色剂的分光光度法定量分析肉桂中单宁含量跟踪提取工艺过程，旨在寻找一条节能高效的提取工艺，为肉桂单宁深度加工和开发高附加值的肉桂单宁产品的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肉桂 产于广西防城，由南宁市景昌中药饮片有限公司提供；儿茶素标准品 中国药品生物制品检定所，纯度为98%；石油醚（沸程60 ～90℃）、香草醛、浓硫酸、无水乙醇、甲醇 均为市售分析纯。

FZ102型微型植物粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；DF-101B型集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英谷予华仪器厂；RE-52A型真空旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；KQ-600DB型超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；AR224CN型电子天平 OHAUS国际贸易有限公司；DL-6000B型大型离心机 上海安亭科学仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂；UV-2550型紫外可见分光光度计 日本岛津公司。

1.2 工艺流程

干燥肉桂→粉碎过60目筛→石油醚回流脱脂→脱脂肉桂粉→溶剂法/超声辅助提取→离心（4200r/min，10min）、真空旋转蒸发浓缩（40℃）、干燥、称重→称取一定量的粗提物→蒸馏水溶解、定容得样品溶液→显色并用紫外分光光度计测定吸光度→计算单宁含量。

1.3 肉桂中单宁含量测定方法

采用改良的香草醛-硫酸法[21]测定肉桂单宁含量。

1.3.1 试剂的制备 准确称取儿茶素标准品50mg置于50mL棕色容量瓶中，蒸馏水溶解并定容，摇匀，即得质量浓度为1mg/mL的对照品储备液。准确吸取储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分别置于10mL棕色容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，配制成质量浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/mL的系列儿茶素标准溶液。再分别配制质量浓度为30mg/mL香草醛-甲醇溶液和体积分数为30%硫酸-甲醇溶液。

1.3.2 标准曲线的绘制 准确量取质量浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/mL的儿茶素标准溶液各0.5mL于6只25mL的棕色容量瓶中，依次加入2.5mL 30mg/mL香草醛-甲醇溶液、2.5mL30%硫酸-甲醇溶液，摇匀，30℃条件下放置20min。以蒸馏水和相应体积的试剂做参比液，以0.20mg/mL儿茶素标准溶液及样品溶液显色后，在400 ～700nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长，再在最大吸收波长处测定系列浓度标液吸光度。以浓度C（mg/mL）为横坐标、吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 肉桂单宁得率的计算 计算式为：

式中：C0为待测样品溶液的质量浓度mg/mL；V0为待测样品溶液的体积，mL；m1为脱脂肉桂粉的质量，g；m2为配制待测样品溶液时所称取的粗提物的质量，g；m3为提取所得粗提物的总质量，g。

1.4 单因素实验设计

1.4.1 溶剂法提取肉桂单宁实验 以5.0g脱脂肉桂粉作为提取对象，肉桂单宁得率为考察指标，分别考察乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间4个因素对溶剂法提取肉桂单宁得率的影响，选择最佳单因素提取条件。

1.4.1.1 乙醇体积分数的影响 采用料液比为1∶20（g/mL），提取时间2.5h，提取温度70℃，乙醇浓度分别40%、50%、60%、70%、80%、90%，分别考察肉桂单宁的得率。

1.4.1.2 料液比的影响 采用乙醇体积分数60%，提取时间2.5h，提取温度70℃，料液比分别1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL），分别考察肉桂单宁的得率。

1.4.1.3 提取温度的影响 采用乙醇体积分数60%，料液比为1∶40（g/mL），提取时间2.5h，提取温度分别40、50、60、70、80℃，分别考察肉桂单宁的得率。

1.4.1.4 提取时间的影响 采用乙醇体积分数60%，料液比为1∶40（g/mL），提取温度70℃，提取时间分别1.5、2.5、3.5、4.5、5.5h，分别考察肉桂单宁的得率。

1.4.2 超声波辅助法提取肉桂单宁实验 以5.0g脱脂肉桂粉作为提取对象，肉桂单宁得率为考察指标，分别考察乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间和超声功率5个因素对超声波辅助法提取肉桂单宁得率的影响，选择最佳单因素提取条件。

1.4.2.1 乙醇体积分数的影响 采用料液比为1∶20（g/mL），提取时间40min，提取温度50℃，超声功率360W，乙醇浓度分别40%、50%、60%、70%、80%、90%，分别考察肉桂单宁的得率。

1.4.2.2 料液比的影响 采用乙醇体积分数60%，提取时间40min，提取温度50℃，超声功率360W，料液比分别1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），分别考察肉桂单宁的得率。

1.4.2.3 提取温度的影响 采用乙醇体积分数60%，料液比为1∶20（g/mL），提取时间40min，超声功率360W，提取温度分别30、40、50、60、70℃，分别考察肉桂单宁的得率。

1.4.2.4 提取时间的影响 采用乙醇体积分数60%，料液比为1∶20（g/mL），提取温度50℃，超声功率360W，提取时间分别1.5、2.5、3.5、4.5、5.5h，分别考察肉桂单宁的得率。

1.4.2.5 超声功率的影响 采用乙醇体积分数60%，料液比为1∶20（g/mL），提取时间40min，提取温度50℃，超声功率分别240、300、360、420、480W，分别考察肉桂单宁的得率。

1.5 正交实验设计

1.5.1 溶剂法提取单宁正交实验 在单因素实验的基础上，选取乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度4个因素，以肉桂单宁的得率为考察指标，进行L9（34）正交实验，对肉桂单宁的提取工艺进行优化，因素水平见表1。

1.5.2 超声辅助提取单宁正交实验 在单因素实验的基础上，固定料液比为1∶20g/mL，选取乙醇体积分数、超声功率、提取时间、提取温度4个因素，以肉桂单宁的得率为考察指标，进行L9（34）正交实验，对肉桂单宁的提取工艺进行优化，因素水平见表2。

表2 超声辅助法正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels of the orthogonal test for ultrasonic extraction

2 结果与分析

2.1 肉桂单宁的定量分析

2.1.1 肉桂单宁和儿茶素的紫外可见光谱及儿茶素的标准曲线 配制儿茶素标准品溶液及肉桂单宁提取物溶液，经香草醛-硫酸显色后，在400 ～700nm波长范围内扫描，结果见图1。儿茶素标准溶液和肉桂单宁粗提物溶液在500nm左右均有最大吸收，故选择500nm为测定波长。在500nm波长处测定系列浓度标液吸光度。以浓度C（mg/mL）为横坐标、吸光度A为纵坐标，绘制儿茶素标准曲线（见图2）。结果表明：儿茶素在0.05 ～0.30mg/mL线性范围内，线性回归方程为：Y=3.0153X+0.0050，R2=0.9997。

图1 儿茶素和样品溶液的最大吸收波长扫描图Fig.1 Maximum absorption wavelength scanning of catechin and sample solution

图2 儿茶素标准曲线Fig.2 Standard curve of catechins

2.1.2 方法学考察结果 通过方法学考察结果显示，该定量方法精密度良好，RSD=0.33%（n=5）；在10 ～50min内稳定性良好，RSD=0.68%（n=9），本实验中选择显色时间为20min；平均加标回收率为101.08%，RSD=3.31%（n=5），故该方法精密度和稳定性高，适于肉桂单宁的含量测定。

2.2 肉桂单宁提取条件的优化

2.2.1 乙醇体积分数对肉桂单宁得率的影响 由图3可知，随着乙醇体积分数增大得率也逐渐升高，在乙醇体积分数为60%时达到最大，随后开始降低，而且对超声辅助法的影响较溶剂法更为显著。这是由于随着乙醇体积分数的增加溶剂极性也逐渐降低，其他醇溶性杂质大量溶出使得得率降低。超声波空化作用使得单宁等物质与溶剂接触更充分，影响更显著。

图3 乙醇体积分数对肉桂单宁得率的影响Fig.3 Effect of the ethanol concentration on yield of tannin from cinnamon

2.2.2 料液比对肉桂单宁得率的影响 由图4可知，料液比较小时，单宁得率随着溶剂量增加而呈现上升趋势，这是因为溶剂量的，增大了单宁类物质扩散空间，降低了原料颗粒周围有效成分浓度，有利于单宁类物质分子从物料高浓度部位向低浓度的溶液中运动、传递和扩散，而后溶剂量继续增加，单宁得率稍微下降后趋于平缓，这是因为溶剂量增大到一定程度时，其他杂质大量溶出，浓度差减小，导致单宁不能很好溶出，之后原料颗粒与溶剂接触面积相对稳定，浓度差趋于平衡，传质影响稳定。溶剂量过大会增加后续提取液浓缩、分离纯化等工作压力以及能量和时间消耗，故分别选择1∶40g/mL和1∶20g/mL为溶剂法和超声辅助法提取肉桂单宁的最佳料液比。

2.2.3 提取温度对肉桂单宁得率的影响 由图5可知，肉桂单宁得率随着提取温度的增加先升高后下降，相对溶剂法而言，超声辅助法受温度影响更显著。由于单宁类物质在乙醇溶液中的溶解度和扩散速度随着温度的升高而逐渐增大，但温度继续升高也会使得乙醇挥发，同时单宁类物质可能部分被氧化，活性成分受到了一定破坏，故溶剂法和超声辅助法最佳提取温度分别为70℃和50℃，超声辅助法最佳提取温度更低，更有利于单宁类物质的稳定。

图5 提取温度对肉桂单宁得率的影响Fig.5 Effect of the extraction temperature on yield of tannin from cinnamon

图6 提取时间对肉桂单宁得率的影响Fig.6 Effect of the extraction time on yield of tannin from cinnamon

2.2.4 提取时间对肉桂单宁得率的影响 由图6可知，肉桂单宁得率随着提取时间延长呈现先升高后下降的趋势。这是因为肉桂成分相对比较复杂，提取时间延长使杂质成分溶出，部分单宁类物质因部分组织过热及杂质影响结构被破坏，从而导致单宁得率降低。综合考虑，溶剂法和超声辅助法提取肉桂单宁最佳提取时间分别为2.5h和40min，这样超声辅助法提取时间明显少于溶剂法，使用超声辅助法提取效率更高。

2.2.5 超声功率对肉桂单宁得率的影响 由图7可知，单宁得率随着超声功率的增大而逐渐升高，在360W附近达到最大，超过360W以后，开始降低。这是由于随着超声波功率增大，空化作用增强，体系中单宁分解的速度也增加。故选择360W为超声辅助法提取的最佳超声功率。

图7 超声功率对肉桂单宁得率的影响Fig.7 Effect of the ultrasonic power on yield of tannin from cinnamon

2.2.6 正交实验结果两种提取方法的L9（34）正交实验结果分别见表3、表4，从表3极差分析结果可以看出，各因素对溶剂法提取单宁得率的影响主次顺序为B＞C＞A＞D，即：提取时间＞提取温度＞料液比＞乙醇体积分数。溶剂法提取最佳组合条件为A1B2C2D2，即：乙醇体积分数60%，料液比为1∶30（g/mL），提取时间为2.5h，提取温度为70℃，与正交实验单宁得率最高的实验组2条件一致。

表3 溶剂法正交实验设计及结果分析Table 3 Orthogonal experimental design and result analysis of solvents extraction

从表4中极差分析结果可以看出，各因素对超声辅助法提取单宁得率的影响主次顺序为C＞D＞A＞B，即：超声功率＞乙醇体积分数＞提取温度＞提取时间。超声辅助法提取最佳组合条件为A1B2C2D1，即提取温度40℃，提取时间40min，超声功率360W，乙醇体积分数50%。该组合不在正交表中，为此对最佳组合进行了验证实验。

表4 超声辅助法正交实验结果及分析Table 4 Orthogonal test results and analysis ofultrasonic extraction

2.2.7 验证实验 按照超声提取法的优化条件，进行3次提取平行实验，经计算：超声辅助法提取肉桂单宁得率分别为：41.58、40.97、41.29mg/g，平均得率为41.28mg/g，比正交实验最高单宁得率40.08mg/g提高幅度2.99%，且RSD=0.74%（n=3），实验结果说明，优化后的工艺提取条件单宁得率高、稳定性好，正交实验结果准确可靠。

2.2.8 两种提取方法的比较 由表5可知，采用溶剂法和超声辅助法提取单宁时，两种方法的得率相近，但溶剂法用时约是超声辅助法用时的4倍，溶剂法乙醇体积分数、料液比及提取温度均比超声辅助法高。乙醇体积分数高增加了生产成本，料液比高使得后期浓缩纯化耗时较长，提取温度高一方面可能对所提单宁结构性质产生影响，另一方面所消耗的能量也会增加。综上所述，从能耗和效率的角度考虑，超声辅助法能耗低效率高，更适合于工业化生产。

表5 两种单宁提取方法的比较Table 5 The comparison of two methods of extracting tannin

3 结论

3.1 以儿茶素为标准品，建立了香草醛-硫酸法测定肉桂单宁含量的测定方法，在500nm测定波长下，得到儿茶素含量与吸光度在0.05 ～0.30mg/mL浓度范围内的线性回归方程为：Y=3.0153X+0.0050，R2=0.987。

3.2 经过正交优化，溶剂法最佳工艺条件为：乙醇体积分数60%，料液比为1∶30g/mL，提取时间为2.5h，提取温度为70℃。超声辅助法最佳工艺条件为：料液比为1∶20g/mL，提取温度40℃，提取时间40min，超声功率360W，乙醇体积分数50%，此条件下单宁得率为41.28mg/g。超声辅助法提取肉桂单宁比溶剂法更加节能、省时，有利于工业化规模生产。

[1]孙达旺.植物单宁化学[M].北京：中国林业出版社，1992.

[2]何洪英.单宁的生理活性[J].饮料工业，2001，4（5）：19-21.

[3]黄占华，方桂珍.植物单宁的应用及研究进展[J].林产化工通讯.2005，39（5）：39-43.

[4]宋立人.肉桂的考证[J].南京中医药大学学报：自然科学版，2001，17（2）：73-75.

[5]LI Y Q，KONG D X，WU H.Analysis and evaluation of essential oil components of cinnamon barks using GC-MS and FTIR spectroscopy[J].Indus trial Crops and Products，2013，41：269-278.

[6]库咏峰，黄品鲜，陈萍，等.肉桂总黄酮提取工艺及其抗氧化性研究[J].应用化工，2011，40（9）：1547-1552.

[7]LI R，LIANG T，XU L Y，et al.Protective effect of cinnamon polyphenols against STZ-diabetic mice fed high-sugar，high-fat diet and its underlying mechanism[J].Food and Chemical Toxicology，2013（51）：419-425.

[8]于峰，王厚伟，李兆明，等.肉桂多糖对四氧啼淀致实验性糖尿病小鼠降糖作用的研究[J].食品与药品，2009，11（11）：1-3.

[9]李健，陈姝娟，张若男，等.超声辅助溶剂法提取肉桂总皂苷工艺的研究[J].食品科学，2008，29（4）：177-180.

[10]赵秀玲.肉桂生理活性成分的研究进展[J].中国调味品.2013，38（3）：5-13.

[11]O’MAHONY R，AL-KHTHEERI H，WEERASEKERA D，et al.Bactericidal and anti-adhesive properties of culinary and medicinal plants against Helicobacter pylori[J].World Journal of Gastroenterology，2005，11（47）：7499-7507.

[12]卢兆莲.肉桂多酚的降糖作用及其作用机制[D].上海：第二军医大学，2011.

[13]ANDERSON R A.Chromium and polyphenols from cinnamon improve in sulinsensitivity[J].Proceedings of the Nutrition Society，2008（67）：48-53.

[14]LEE J S，JEON S M，PARK E M，et al.Cinnamate supplementation enhances hepatic lipid metabolism and antioxidant defense systems in high cholesterol-fed rats[J].Medicinal Food，2003，6（3）：183-191.

[15]井藤千裕.从热带药用植物中筛选抗促癌物质：肉桂酚类的抗促癌作用[J].国外医学·中医中药分册，2003，25（6）：374.

[16]平华.肉桂中多酚物质水提工艺的研究[J].食品科技，2008（6）：158-160.

[17]中国药科大学，江苏九寿堂生物制品有限公司.一种肉桂多酚提取物、其制备方法及其用途[P].中国：201110197202，2011-12-14.

[18]天津市聚星康华医药科技有限公司.一种肉桂总多酚提取物的制备方法及其应用：中国，201210434838[P].2013-01-16.

[19]梁秋霞.肉桂有效成分提取及其生物活性研究[D].南宁：广西大学，2010.

[20]黎超，毛超伦，雍克岚.肉桂原花青素的提取及其对高级糖基化终产物形成的抑制作用[J].食品科学，2012，33（8）：126-130.

[21]杨依姗，李春美，陈美红.香草醛/硫酸法测定柿子单宁含量条件的优化[J].食品科技，2010，35（12）：267-271.