樟子松树皮多酚体外抗氧化活性的研究

刘 荣，姜元松，何 娇，王振宇，2，*

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040；2.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090）

近年来由于抗氧化剂能消除由人体产生的内源性自由基，减少自由基氧化损伤人体生物大分子，因而备受关注，而合成的抗氧化剂安全性受到质疑，所以从食源性植物中找到可以开发利用的天然抗氧化剂具有重要意义。植物多酚由于其酚羟基能提供活泼质子而成为具有清除自由基及抗氧化功能的物质，其抗氧化效果甚至高于BHA（叔丁基羟基茴香醚）和BHT（2，6-二叔丁基对甲酚）等人工合成的抗氧化剂[1]。孙建霞等[2]开展苹果多酚对菜籽油和猪油的抗氧化性能实验表明，苹果多酚对植物油和动物油均具有较明显的抗氧化效果，且对植物油抗氧化效果要远优于BHT，张峻等[3]利用不同的有机溶剂对葡萄籽进行提取多酚，其多酚对猪油有很好的抗氧化性能，且效果优于BHT。Aviram M等[4]也曾报道多酚类物质能抑制低密度脂蛋白的氧化性。

樟子松（Pinus sylvestris L.）又名海拉尔松（日）、西伯利亚松，为松科乔木，是我国三北地区主要优良造林树种之一。因其中含黄酮、多酚类物质、有机酸、鞣质等丰富的有效成分而具有药用开发价值。近期研究发现松科植物体内含有大量的生物活性的多酚类化合物，这类物质统称为松多酚。松多酚的独特结构赋予了它一系列独特的化学性质，不仅使其成为一种色素类天然抗氧化剂[5]，还使其具有抗肿瘤[6]、防治冠心病与中风等心脑血管疾病、抗动脉硬化、降血脂降血糖[7-8]以及抗菌等多种生理功能。松多酚作为一种天然抗氧化剂，会伴随着饮食摄入后，通过机体吸收增加血液抗氧化能力，有助于预防癌症和心脑血管疾病的发生，因而在健康、营养以及医药领域的关注度逐渐提高[9]。目前，关于松多酚体外抗氧化效果的研究评价相对较少。

本文以樟子松树皮为原料，旨在通过提取一种新型来源的植物多酚—松多酚并对其进行纯化，通过研究纯化前后主要化学成分含量以及其体外抗氧化活性，为樟子松树皮多酚的开发利用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

樟子松（Pinus sylvestris L.）树皮 收集于黑龙江哈尔滨，收集时间为2012年10月份，自然烘干至恒重后粉碎过40目筛，备用；三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、抗坏血酸、芦丁、原花青素 美国Sigma公司；大孔树脂D101 天津海光试剂公司；其他化学试剂 均为国产分析纯。

DK-8D型三孔电热恒温水槽 上海一恒科学有限公司；JA2003型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司；722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；SHB－Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；FW135型中药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；玻璃层析柱（2.5cm×70cm）上海沪西分析仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 原料的制备[10]称取一定质量的樟子松树皮粉末，以体积分数50%的乙醇为作为溶剂，按料液比1∶25进行水浴浸提，水浴温度为50℃，浸提时间4h，将浸提液在4000r/min的条件下离心分离15min后减压浓缩蒸去乙醇，得到多酚粗提物；将上述粗提物在上样浓度3mg/mL，上样体积30mL，洗脱剂乙醇浓度为53%条件下进行一次纯化，控制上样流速5BV/h，洗脱流速4.25BV/h；收集纯化物，减压浓缩蒸去乙醇，得到樟子松树皮多酚一级纯化产物。

1.2.2 主要化学成分含量测定

1.2.2.1 原花青素含量的测定[11]以原花青素浓度为横坐标，546nm波长处吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算试样中原花青素的含量。

1.2.2.2 黄酮含量的测定[12]以50mL中芦丁质量（mg）为横坐标，415nm处吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线求出溶液中黄酮类化合物含量。

1.2.2.3 多酚含量的测定[13]以没食子酸的质量浓度为横坐标，765nm波长下吸光度为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线计算样品中多酚含量。

1.2.3 DPPH自由基清除能力的测定 在Blois[14]测定方法的基础上进行改进：以1mL蒸馏水和3mL无水乙醇混合液做参比，移取1mL提取液加入3mL 1×10-4mol/L DPPH溶液混匀，室温放置30min后测定体系在波长517nm处的吸光值Ai，移取1mL提取液加入3mL无水乙醇溶液混匀，测定517nm处的吸光值Aj，同时测定3mL DPPH溶液与1mL无水乙醇混合液的吸光度A0，按下式计算樟子松多酚对DPPH的清除能力。以抗坏血酸为阳性对照来评价受试物的抗氧化能力。

1.2.4 羟自由基清除能力的测定 在郭盛[15]的方法上进行改进：向试管中依次加入1mmol/L FeSO4溶液1mL，不同提取条件下的樟子松多酚提取液1mL，1mmol/L过氧化氢溶液1mL，3mmol/L水杨酸溶液2mL混匀，室温放置30min后于510nm处测得吸光值Ai，用蒸馏水代替水杨酸测得吸光值Aj，用蒸馏水代替多酚溶液测得吸光值A0，按下式计算樟子松多酚对羟自由基的清除能力。以抗坏血酸为阳性对照来评价受试物的抗氧化能力。

1.2.5 总还原能力的测定 还原能力的测定选取Tsai等[16]采用的铁氰化钾还原显色法。还原能力高低与混合试样700nm下吸光度大小成正相关。以抗坏血酸为阳性对照来评价受试物的抗氧化能力。

1.2.6 对卵黄脂蛋白过氧化抑制作用的测定 在张尔贤等[17]的方法基础上进行修改。取新鲜卵黄，加磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）制备成4%的卵黄悬液。于试管中，依次加入0.2mL质量分数为4%的卵黄悬液，1mL不同浓度的樟子松树皮提取物，0.2mL 25mmol/L的FeSO4溶液，0.6mL 0.0lmol/L pH7.4的磷酸缓冲液，混匀后置于37℃恒温水浴中反应1h。取出后加入质量分数为10%的三氯乙酸1.0mL，充分混合后静置10min，3500r/min条件下离心10min，取上清液2.0mL并加入l.0mL 0.8%的硫代巴比妥酸溶液，置于沸水浴中反应15min，流水冷却至室温后，以磷酸盐缓冲液（0.0lmol/L，pH7.4）空白调零，于532nm波长处测定吸光度值A1；以等体积蒸馏水代替不同浓度樟子松树皮提取物，同法操作测定吸光度值A0；以等体积蒸馏水代替卵黄液，同法操作测定吸光度值A2。按照下式计算樟子松多酚对卵黄脂蛋白过氧化的抑制率。以抗坏血酸为阳性对照来评价受试物的抗氧化能力。

1.2.7 ABTS+自由基清除能力测定 本实验采用碧云天ABTS试剂盒进行测定：在96孔板的孔中依次加入受试样品溶液50μL，以及ABTS溶液250μL，充分混匀于734nm波长下测定混合体系溶液吸光值记为Ai，在另一组加入受试样品溶液50μL的孔中加入磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH=7.4）250μL，充分混匀于734nm波长下测定混合体系溶液吸光值记为Aj，同时在第三组孔中加入蒸馏水50μL以及ABTS自由基工作液250μL作为空白组，避光反应6min，于734nm波长下测混合体系溶液吸光值记为A0。按公式计算樟子松多酚对ABTS+自由基的清除能力，同时以抗坏血酸为阳性对照来评价受试物的抗氧化能力。以抗坏血酸为阳性对照来评价受试物的抗氧化能力。

1.2.8 数据分析 本研究所有进行实验均平行三次，数据表示为：结果±标准差；图像及图表分析均采用Exce（l2007）以及SAS（9.1）软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

根据标准曲线的测定方法，分别得到原花青素标准曲线y=0.0049x+0.0055，R2=0.9993，式中，y-溶液在546nm处的吸光度，x-原花青素浓度（μg/mL）；黄酮标准曲线y=0.6282x+0.0044，R2=0.9994，式中，y-溶液在415nm处的吸光度，x-50mL中芦丁含量（mg）；总酚标准曲线为y=0.01081x+0.0047，R2=0.9994，式中，y-溶液在765nm处的吸光度，x-没食子酸的浓度（μg/mL）。

2.2 主要化学成分含量测定

对纯化前和纯化后的樟子松树皮提取物分别测定其中多酚含量、原花青素含量和黄酮含量，结果如表1所示。樟子松树皮提取物中黄酮含量最低，原花青素含量较高，多酚含量最高，并且经过纯化后各种物质的含量均有所提升，多酚含量提高近一倍，说明大孔树脂对樟子松树皮提取物的纯化具有一定作用。

2.3 樟子松树皮多酚对DPPH自由基的清除作用

樟子松树皮多酚及抗坏血酸对DPPH自由基的清除率测定结果如图1所示。由图1可知，樟子松树皮提取物对DPPH自由基具有显著的清除作用，且在一定浓度范围内，随着样品浓度的增加，对DPPH清除率也逐渐增加。在0 ～50μg/mL的浓度范围内，樟子松树皮提取物对DPPH自由基的清除作用增强显著，成线性增长关系，50μg/mL之后，随受试物浓度升高，清除作用增加不明显。樟子松树皮多酚清除DPPH自由基机理可能是在DPPH乙醇溶液中加入多酚提取物后，其中的抗氧化活性物质可以与DPPH·结合或发生替代，使DPPH·数量减少，溶液颜色变浅，其在517nm波长处的吸光度不断减小，直至达到稳定。经SPSS软件计算，抗坏血酸的半数抑制浓度（IC50）为（11.91±0.24）μg/mL，未纯化和纯化的樟子松多酚的半数抑制浓度（IC50）分别为（29.54±0.98）、（19.47±0.74）μg/mL，说明纯化及未纯化的樟子松树皮多酚对DPPH·的清除作用均弱于阳性对照抗坏血酸，而纯化的樟子松树皮多酚对DPPH自由基的清除作用要强于未纯化的。

图1 樟子松树皮多酚对DPPH自由基的清除作用Fig.1 The DPPH·scavenging activity of Pinus sylvestris L.bark polyphenol

2.4 樟子松树皮多酚对羟自由基的清除作用

通过测定水杨酸捕获羟自由基所得到的产物确定羟自由基的清除率。由图2可知，樟子松树皮多酚对羟自由基具有一定的清除能力，在一定浓度范围内，随着样品浓度的增加，樟子松树皮多酚对羟自由基的清除率逐渐上升，但上升速率缓慢，弱于同浓度的抗坏血酸。在样品浓度为2mg/mL时，未纯化的樟子松树皮提取物对羟自由基的清除率为54.52%±1.66%，纯化的为57.95%±1.37%，同浓度条件下的抗坏血酸对羟自由基的清除率可达99.64%±0.40%。经计算得，抗坏血酸的半数抑制浓度（IC50）为（0.85±0.05）mg/mL，未纯化和纯化的樟子松多酚的半数抑制浓度（IC50）分别为（1.87±0.21）、（1.70±0.14）mg/mL。这是由于松多酚类物质存在一定的转移氢原子的能力，可作为链断裂抗氧化剂抑制自由基的形成。松多酚羟基自由基清除的机理可能为向羟基自由基提供一个氢原子或电子中断链式反应，形成一种较为稳定的物质。此结果表明，樟子松树皮多酚对羟自由基具有一定的清除作用，但效果弱于抗坏血酸。

图2 樟子松树皮多酚对羟自由基的清除作用Fig.2 The OH·scavenging activity of Pinus sylvestris L.bark polyphenol

2.5 樟子松树皮总还原能力

检验受试物是否为良好电子供体的最简单方法就是测定其总还原能力，还原力的测定也是评价抗氧化剂活性较常用的方法。本实验结果显示樟子松树皮多酚具有较强的总还原能力，且与浓度呈正相关，纯化后樟子松树皮多酚的总还原能力强于未纯化的，而两者的还原作用均弱于抗坏血酸。

图3 樟子松树皮多酚总还原能力曲线Fig.3 The reducing ability assay of Pinus sylvestris L.bark polyphenol

2.6 樟子松树皮多酚对卵黄脂蛋白过氧化抑制作用

如图4显示，樟子松树皮多酚可以显著抑制卵黄的过氧化作用。在浓度为0.02mg/mL时，纯化的樟子松树皮多酚对卵黄过氧化的抑制率为70.10%±3.35%，未纯化的樟子松树皮多酚对其抑制率为50.00%±1.60%，而抗坏血酸对其抑制率仅为26.92%±1.06%。浓度为0.1mg/mL时，抑制率基本达到平衡，平衡时纯化的樟子松树皮多酚对卵黄过氧化的抑制率为90.17%±3.73%，未纯化的樟子松树皮多酚对其抑制率为88.25%±2.28%，而抗坏血酸对其抑制率仅为87.61%±3.11%。抗坏血酸对卵黄过氧化的半数抑制浓度（IC50）为（0.041±0.009）mg/mL，未纯化和纯化的樟子松多酚的半数抑制浓度（IC50）分别为（0.017±0.007）、（0.016±0.003）mg/mL。此结果显示，樟子松树皮多酚可以有效抑制卵黄过氧化发生，且抑制作用强于抗坏血酸。

图4 樟子松树皮多酚对卵黄过氧化的抑制作用Fig.4 The inhibition curve of Pinus sylvestris L.bark polyphenol for yelk peroxidation

2.7 樟子松树皮多酚对ABTS+自由基清除作用

图5 樟子松树皮多酚对ABTS+自由基的清除作用Fig.5 The ABTS+·scavenging activity of Pinus sylvestris L.bark polyphenol

纯化前后樟子松树皮多酚及阳性对照抗坏血酸对ABTS+自由基的清除率测定结果如图5所示。由图5可知，未纯化和纯化后的樟子松树皮多酚对ABTS均具有一定的清除能力，并且清除能力略弱于抗坏血酸。当样品浓度为0.5mg/mL时，樟子松树皮多酚对ABTS+自由基的清除率达到稳定，未纯化的清除率为61.99%±0.63%，纯化后的清除率为63.82%±1.28%，此时VC对ABTS自由基的清除率为70.12%±1.35%。经计算得，抗坏血酸的半数抑制浓度（IC50）为（0.039±0.004）mg/mL，未纯化和纯化的樟子松多酚的半数抑制浓度（IC50）分别为（0.18±0.014）、（0.088±0.009）mg/mL。实验结果表明樟子松树皮多酚在清除ABTS自由基方面是不错的抗氧化物质。

3 结论

经过大孔树脂D101纯化，樟子松树皮提取物中原花青素、黄酮以及多酚含量分别由（0.2023±0.0131）、（0.0014±0.0002）、（0.3373±0.0251）mg/mg提高到（0.3158±0.0215）、（0.0022±0.0004）、（0.6414±0.0586）mg/mg，三种物质的含量均有明显提高。

纯化与未纯化的樟子松树皮多酚均具有较强抗氧化能力，并且纯化后的樟子松树皮多酚的抗氧化能力要强于未纯化的樟子松树皮多酚。樟子松树皮多酚对非生理自由基如DPPH自由基、ABTS+自由基均有非常显著的清除能力，清除作用略弱于抗坏血酸；而对生理自由基如羟自由基、超氧阴离子的清除能力较弱；纯化前后樟子松树皮多酚均具有较强的总还原能力；樟子松树皮多酚对卵黄脂蛋白过氧化抑制能力非常强，纯化前和纯化后的多酚对卵黄脂蛋白过氧化抑制能力均强于抗坏血酸。说明樟子松树皮多酚具有显著的抗氧化活性，此结果为樟子松树皮的进一步开发和利用提供有效的依据。

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