MAPK通路在瑞芬太尼预处理减轻心衰大鼠离体心脏缺血／再灌注损伤中的作用

金世云，何淑芳，吴 昊，朱海娟，张书杰，张 野

（安徽医科大学第二附属医院1.麻醉科、2.超声科，安徽 合肥 230601）

慢性心力衰竭是各种心脏疾病发展的终末阶段，这类患者在行心血管手术时更易发生心脏的缺血／再灌注损伤（ischemia／reperfusion injury，IRI），可能导致术后并发症和死亡率增加［1］。因此，寻找一种有效减轻心力衰竭心肌缺血／再灌注损伤的心肌保护策略，在临床上具有重要的理论和实际意义。缺血预处理（ischemic preconditioning，IPC）是迄今为止最强的内源性心肌保护方法，但近年研究表明，在高血糖、高血脂、心肌梗死等病理状态下，心肌对IPC的敏感性减弱或消失［2］。本课题组近期研究发现，IPC对心力衰竭心脏的保护作用明显减弱，但阿片类药物如吗啡、瑞芬太尼预处理仍能发挥心肌保护作用［3－4］，其机制尚待进一步探讨。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路，主要包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal protein kinase，JNK）、p38激酶3个亚族，在阿片类药物介导正常大鼠的心肌保护中发挥重要作用［5］。本研究拟利用阿霉素长期注射诱导的大鼠慢性心力衰竭模型，探讨MAPK信号通路在瑞芬太尼预处理（remifentanil preconditioning，RPC）减轻心力衰竭大鼠离体心脏缺血／再灌注损伤中的作用，将为阿片预处理用于临床预防心力衰竭心脏缺血／再灌注损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品、试剂与仪器 盐酸阿霉素（批号：2QL0061，Prizer公司，意大利），盐酸瑞芬太尼（批号：6130311，宜昌人福药业有限责任公司），伊文斯兰（批号：20110909024，北京绿生源有限公司），氯化三苯基四氮唑（TTC，批号：129K1867V，Sigma公司，美国），乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），ERK抑制剂PD98059、p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125（均购自 Cell Signaling公司），Power Lab数据采集系统（AD公司，澳大利亚），Langendorff灌注系统（安徽淮北正华有限责任公司），Vivid 7.0彩色超声仪（GE公司，美国）。

1.2 动物模型制备与分组处理 健康♂SD大鼠，由安徽医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK（皖）2005－001，体质量 200～230 g，参照文献［6］介绍的方法制备慢性心力衰竭模型，于第8周末通过Vivid 7.0彩色超声仪评价大鼠心功能。将模型制备成功的慢性心力衰竭大鼠，通过随机数字表分为9组（n＝6）：假手术组（sham）、缺血／再灌注组（IR）、瑞芬太尼预处理组（RPC）、ERK抑制剂PD98059＋RPC组（RPD）、p38抑制剂 SB203580＋RPC组（RSB）、JNK抑制剂 SP600125＋RPC组（RSP）以及抑制剂对照组（PD、SB和SP）。大鼠断头，取出心脏放在预先准备的4℃K-H液中，立即悬挂于Langendorff灌注架，逆行恒压灌注，灌注液为K-H 液 （118.5 NaCl，4.7 KCl，1.2 MgSO4，1.2 KH2PO4，2.5 CaCl2，25.0 NaHCO3，11.0 Glucose，单位为 mmol·L－1）。用体积分数为95%的O2与5%的CO2的混合气进行平衡，维持灌注液的pH值在7.4左右，温度稳定于37℃。用6-0丝线在肺动脉圆锥与左心耳之间缝扎左前降支起始部位，左心耳处剪一小口，将乳胶水囊自该小口置入左心室内，连接Power Lab系统，调节水囊内的容积，维持左心室舒张末压在0～1.33 kPa之间。实验中，通过收紧线结，实现左前降支支配区域心肌缺血与再灌注，缺血时表现为：缺血区域发绀、冠脉流量下降及LVDP减小。全部操作完成后，心脏稳定15 min，有明显心律失常以及LVDP＜12 kPa的心脏弃之不用。Sham组仅缝线不结扎，持续灌注。IR组在平衡后，给予结扎左前降支30 min，松开线结后再灌注120 min。RPC组在平衡后，行5 min瑞芬太尼预处理（50μg·L－1），间隔 5 min，共 3个循环，然后缺血 30min，再灌注 120 min。RPD、RSB、RSP组在RPC预处理前10 min分别给予溶有ERK抑制剂PD98059（10μmol·L－1）、p38抑制剂 SB203580（5 μmol·L－1）或 JNK抑制剂 SP600125（5μmol·L－1）的K-H液灌流，直至缺血开始后5 min，共45 min。抑制剂对照PD组、SB组及SP组在IR前仅给予各抑制剂，不进行瑞芬太尼预处理。

1.3 LDH检测 所有组收取平衡15 min后（baseline）、再灌注后5 min（P5）及10 min（P10）的冠脉流出液，化学比色法检测LDH活性。

1.4 心肌梗死面积检测 再灌注末，取下大鼠心脏，吸干表面水份，称量，记录心脏湿重。取下大鼠心脏后，再次结扎左前降支，用0.25%的伊文斯兰通过主动脉逆行灌注对心脏进行染色，非缺血区心肌蓝染，缺血区无蓝染，放于－80℃冰箱20 min左右，行冰冻切片，沿心脏纵轴线切5～6片，每片为2 mm。切片在1%TTC溶液中，37℃中孵育10～15 min，随后再用10%中性福尔马林液固定过夜，梗死区（IS）呈白色，缺血危险区（AAR）呈砖红色。通过Imaging J 1.38e图像分析软件计算左心室与右心室总体积（LV＋RV）、AAR体积，IS体积及 IS／AAR的比值。

1.5 心功能指标检测 通过Power Lab系统分别记录各组平衡 15 min（baseline）、预处理结束后（treatment）、缺血 30 min末（ischemia）、再灌注 60 min（P60）及再灌注120 min（P120）时心率（HR）、左心室发展压（LVDP）、左心室压力最大上升速率（＋d p／d tmax）、左心室压力下降最大速率（－d p／d tmax）及冠脉流出液（CF）5种血流动力学指标。

1.6 统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件进行分析，计量资料以¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，重复测量资料采用重复测量设计的方差分析。

2 结果

2.1 冠脉流出液中LDH活性 再灌注5 min和10 min时，与sham组LDH活性相比（5 min：77±10，10 min：76±11），IR组 LDH活性明显升高（5 min：278±31，10 min：203±32；P＜0.01）。而 RPC可以明显降低再灌注5 min和10 min的LDH活性（5 min：203±33，P＜0.01；10 min：162±16，P＜0.05）。再灌注5 min时，JNK抑制剂SP600125可明显阻断RPC降低LDH活性的作用（265±32，P＜0.01）；ERK抑制剂PD98059也有部分阻断作用（238±24，P＜0.05）；而p38抑制剂SB203580有升高LDH活性的趋势，但与RPC相比，差异无统计学意义。PD、SB、SP组在再灌注5 min和10 min时的LDH活性与sham组相比，差异有显著性，而与IR组相比差异无统计学意义。各组基础LDH活性差异无统计学意义（单位：IU·L－1）。见 Fig 1。

2.2 心肌梗死面积 与sham组（0.08±0.03）相比，IR组的 IS／AAR明显增加至（0.50±0.10），P＜0.01；RPC则可以明显减轻IR损伤，IS／AAR降低到（0.23±0.08），P＜0.01，这提示 RPC可以发挥心肌保护作用。与RPC相比，RSP和RPD的IS／AAR明显增加（RPD：0.36±0.09，P＜0.05；RSP：0.48±0.12，P＜0.01），而 RSB的无明显增加（0.30±0.04，P＜0.01），这提示 JNK信号通路抑制剂和ERK通路抑制剂可以完全或部分阻断RPC的心肌保护作用。PD、SB、SP组IS／AAR与sham组相比，差异有统计学意义，而与IR组相比差异无统计学意义。各组在心重、LV＋RV及AAR上差异无统计学意义。见Fig 2。

Fig 1 LDH activity in coronary effluent in each group（±s，n＝6）1：Sham；2：IR；3：RPC；4：RPD；5：RSB；6：RSP；7：PD；8：SB；9：SP.The LDH activity was detected at baseline，5 min and 10 min after reperfusion（P5 and P10），respectively.*P＜0.05，**P＜0.01 vs IR group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs RPC group；＃＃P＜0.01 vs sham group.

Fig 2 Infarct size determined by TTC staining in each groupA：Infarct size expressed as a percentage of the area at risk in groups subjected to RPC in the absence or presence of MPAK inhibitors；1：Sham；2：IR；3：RPC；4：RPD；5：RSB；6：RSP；7：PD；8：SB；9：SP.*P＜0.05，**P＜0.01 vs IR group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs RPCgroup；＃＃P＜0.01 vs sham group.B：Representative images of AAR showing viable tissue（red）and infarcted tissue（white）for experimental groups.

2.3 血流动力学变化 I／R组在缺血30 min末、再灌注60 min及120 min 3个时间点上，LVDP、HR、＋d p／d tmax、－d p／d tmax4个指标与 sham组相比，差异有统计学意义，说明缺血／再灌注损伤导致心脏功能的下降。除sham组外，其余各组间血流动力学差异无显著性，这提示瑞芬太尼预处理对离体心脏功能没有明显改善作用。见Tab 1。

3 讨论

瑞芬太尼是临床麻醉中常用的新型阿片类镇痛药，主要是μ-阿片受体激动剂，同时，对δ、κ受体也有一定激动作用。我们前期研究表明，瑞芬太尼预处理不仅可以抗正常大鼠心脏缺血／再灌注损伤，还可以明显减轻慢性心力衰竭大鼠的心肌缺血后损伤［3，7］。本实验根据前期研究方法成功建立慢性心力衰竭和离体心脏缺血／再灌注损伤模型［3，6］，并选择浓度为50μg·L－1的瑞芬太尼进行预处理，结果显示，RPC明显缩小缺血后心肌梗死面积，并降低再灌注5 min和10 min时的LDH活性，证实RPC可以减轻心肌IR损伤，对心力衰竭大鼠心脏产生保护作用。

阿片类药物预处理主要是通过激活心脏上的阿片受体，继而活化下游的多种蛋白激酶，包括蛋白激酶 C（PKC）、PI3K／Akt（磷脂酰肌醇-3-激酶／蛋白激酶）、MAPK等，经过蛋白磷酸化作用激活线粒体KATP通道，从而对心肌产生保护作用。本研究利用3种MAPK信号通路抑制剂，进一步探讨MAPK信号通路在RPC介导心衰大鼠心肌保护中的作用。在RPC开始前10 min应用JNK通路抑制剂SP600125、ERK通路抑制剂PD98059或p38通路抑制剂 SB203580，结果 SP600125几乎完全阻断了RPC的心肌保护作用，PD98059有部分阻断作用，而SB203580对RPC心肌保护作用无明显影响，提示RPC介导心力衰竭大鼠的心肌保护作用与预处理阶段JNK和ERK信号通路的活化有关。

既往研究表明，心肌缺血／再灌注或预处理过程均可能导致MAPK信号通路活化，其中，ERK通路活化大多被认为对心脏起保护作用，其活化可以依赖或不依赖于 PI3K／Akt信号通路［8－9］。然而，JNK和p38通路是否介导心脏保护作用仍存在争议，不同的研究认为这两条通路的活化可能产生心脏保护作用，也可能对心脏有害［10］。我们前期研究发现，RPC对正常大鼠在体心脏缺血／再灌注损伤的保护作用与 JNK和 p38通路活化有关［11－12］。然而，本研究中RPC发挥对心力衰竭大鼠的心肌保护作用，主要依赖JNK通路活化，其次是ERK通路，而与p38通路无明显关系。当心脏发生病理性改变时，某些蛋白激酶信号途径可能发生改变。Miki等［13］研究发现，梗死后心肌重构导致PI3K／Akt信号通路失活，而代偿性ERK通路激活有利于心肌保护。在糖尿病大鼠模型中，PI3K及ERK等信号通路改变，可能导致吗啡预处理的心肌保护作用消失［14］。Peart等［15］研究发现，在老年小鼠心脏中，阿片受体激动剂由于不能激活p38通路，导致其心肌保护作用消失。在心力衰竭情况下，ERK、JNK及p38信号通路活化状态发生异常改变［16］，这可能导致RPC介导心力衰竭大鼠心肌保护中涉及的MAPK通路与正常情况下有所不同，但其具体机制尚需进一步阐明。

Tab 1 Hemodynamic parameters in each group（¯±s，n＝6）

Tab 1 Hemodynamic parameters in each group（¯±s，n＝6）

＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs sham group

－d p／d t max／kPa·s－1 CF／ml·min－1 179±33 192±55 162±45 149±45 176±24 129±11 72±15＃91±41 102±26 90±20 110±29 119±29 90±17 100±18 6.3±3.0 5.3±2.3 6.2±1.6 3.7±1.5 3.8±1.1 6.2±2.1 4.1±0.8 4.1±0.7 4.0±1.2 RSP PD SB SP sham IR RPC RPD RSB RSP PD SB SP sham IR RPC RPD RSB RSP PD SB SP 297±49 361±67 397±80 377±73 239±70 196±28 252±46 246±46 275±65 212±37 233±42 214±20 246±61 14.0±1.7 14.8±3.8 17.1±3.2 15.2±5.3 13.4±2.4 14.2±4.4 17.5±2.7 16.8±4.1 16.8±4.6 272±45 314±97 255±17 317±55 211±63 173±40 181±63 213±46 174±47 168±25 192±17 201±18 200±46 11.2±2.3 9.9±1.6 13.1±4.7 8.7±2.5 7.1±2.5 12.1±5.3 13.2±1.8 9.6±2.9 11.2±5.5 159±58＃＃162±39＃＃163±55＃＃178±39＃＃186±58 59±15＃＃88±43＃＃106±32＃＃111±34＃＃92±37＃＃90±25＃＃89±34＃＃103±20＃＃8.5±2.6 5.4±2.0 6.2±2.5 3.9±2.1＃4.1±1.4 6.1±1.4 4.0±1.1＃4.9±1.5 3.9±1.4 197±74 186±67 182±42 203±77 247±40 168±28 91±18＃110±41 113±24 135±60 111±39 140±23 106±34 149±25 7.3±2.5 6.7±1.8 7.2±2.2 4.3±1.7 4.3±1.2 7.8±2.6 4.5±1.0 5.9±1.7 4.5±1.3

综上所述，JNK和ERK信号通路在瑞芬太尼预处理减轻心力衰竭大鼠离体心脏的缺血／再灌注损伤中发挥重要作用。

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