我国不同产地黑茶的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱研究

胡 燕，齐桂年

(四川农业大学园艺学院，四川雅安625014)

黑茶是我国六大茶类之一，属于后发酵茶，以边销为主，主产区为湖南、四川、云南、湖北、广西等省［1］。过去对黑茶的研究主要集中在品质化学成分［2－3］、加工过程中微生物种群的分离鉴定［4］和降氟技术［5］等方面;现有国家标准对黑茶质量的评价主要是测定水分、总灰分、水浸出物等理化指标并结合感官审评［6－8］，难以全面反映其质量。

化学指纹图谱是指在固定的实验条件下将待测物经适当处理后得到的能标示其化学特征的谱图［9］，其中的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱可用于分析茶叶中的非挥发性成分，目前该技术已广泛应用于中药的真伪鉴别、质量控制、新药开发等领域［10－11］，但应用于黑茶的研究较少［12－14］。二极管阵列检测器(DAD)是HPLC中较常用的紫外检测器，但无法直接检测茶叶中的氨基酸类和多糖类等无紫外吸收或仅有弱紫外吸收的组分［15－16］，同时，对于紫外特征吸收有差异的各物质往往不能在同一检测波长下同时得到很好的响应;蒸发光散射检测器(ELSD)作为一种通用型质量检测器，产生的响应只与分析成分的质量相关，而不依赖于其光学性质［17］，而且在梯度洗脱时流动相不产生背景干扰，克服了传统紫外检测器的不足，但灵敏度低于DAD。考虑到黑茶样品中同时含有紫外吸收和无紫外吸收的组分，本研究拟运用HPLC－DAD－ELSD联用技术，构建我国黑茶的HPLC－DAD－ELSD指纹图谱，以期更全面地反映我国黑茶中非挥发性成分的化学特征，并为对我国黑茶的鉴别和质量的客观评价提供一种新的思路。

1 材料与方法

表1 茶样及来源Table 1 Tea samples and the origin

1.1 材料与仪器

试验采用的黑茶成品样取自我国6个黑茶主产地的18个不同厂家，每个产地取6个茶样，共计36个样品，生产年份均为2012年;并选取2012年生产的其它5大茶类的样品各一个，普洱生茶样品一个作为对照，样品来源见表1。

甲醇 色谱纯，美国Fisher公司;水 超纯水;三氟乙酸 色谱纯，天津科密欧化学试剂开发中心;谷氨酸(CAS号:56－86－0)、L－茶氨酸(CAS 号:3081－61－6)、没食子酸(CAS 号:149－91－7)、咖啡因(CAS号:58－08－2)、表没食子儿茶素(EGC)(CAS 号:970－74－1)、儿茶素(C)(CAS 号:154－23－4)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)(CAS号:989－51－5)、表儿茶素(EC)(CAS号:490－46－0)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)(CAS号:4233－96－9)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)(CAS号:1257－08－5)对照品 均购自中国标准物质中心。

Dionex Ultimate3000U高效液相色谱仪 配有双三元输液泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器(DAD)美国Dionex公司;变色龙软件Chromeleon7.1 美国Dionex公司;Alltech 2000ES蒸发光散射检测器(ELSD)美国奥泰科技中国有限公司;XWK－Ⅲ无油空气泵 天津市津分分析仪器制造有限公司;超声波清洗器 上海冠特超声波仪器有限公司;电子天平 德国赛多利斯股份公司;台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂;电热恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司;微型植物实验粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;arium comfortⅠ纯水机 德国赛多利斯股份公司。

1.2 色谱条件

流动相A:0.1%的三氟乙酸水溶液;流动相B:甲醇。色谱柱:Thermo scientific C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)。DAD检测波长:280nm。柱温:30℃。流速:1.0mL/min。ELSD采用不分流模式，漂移管温度:110℃，空气流量:2.8L/min。分析时间:65min。

梯度洗脱程序:0～3min，3%B;3～8min，3%B～8%B;8～15min，8%B～17%B;15～20min，17%B～20%B;20～27min，20%B～22%B;27～33min，22%B～33%B;33～39min，33%B～38%B;39～44min，38%B～43%B;44～53min，43%B～70%B;53～60min，70%B～30%B;60～65min，30%B～3%B。系统平衡色谱柱时间:15min。

1.3 样品前处理

称取2.00g粉碎茶样(过40目筛)于250mL具塞锥形瓶中，加入140mL 90℃的超纯水，立即移入90℃水浴中浸提15min，每隔5min摇动一次。浸提完毕后，冷却至室温，离心15min(转速4000r/min)，取上清液用0.45μm水相滤膜过滤后进行HPLCDAD－ELSD分析，进样量为20μL。

1.4 数据统计

将黑茶样品的HPLC－DAD－ELSD图谱数据分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)软件中，生成我国黑茶的HPLC－DAD和HPLCELSD指纹图谱共有模式并计算黑茶样品及对照茶样与黑茶指纹图谱共有模式的相似度。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

将36个黑茶样品的 HPLC－DAD和 HPLCELSD色谱图数据分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)软件中，生成我国黑茶的HPLC－DAD和HPLC－ELSD指纹图谱共有模式(图1、图2)，在图1中选择出峰时间适中、峰面积在色谱图中所占比例较大且在各黑茶样品中均稳定存在的13号峰作为参照峰;在图2中选择在各黑茶样品中均稳定存在的10号峰作为参照峰。

图1 我国不同产地黑茶的HPLC－DAD指纹图谱共有模式Fig.1 Common pattern simulated from HPLC－DAD fingerprinting of dark teas from different regions in China(common peaks:1～27)

图2 我国不同产地黑茶的HPLC－ELSD指纹图谱共有模式Fig.2 Common pattern simulated from HPLC－ELSD fingerprinting of dark teas from different regions in China(common peaks:1～15)

2.1.1 精密度试验 取同一份黑茶样品按1.3制备，在1.2的色谱条件下连续进样6次，以图1中的13号峰为参照峰，测得HPLC－DAD图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.12%～1.05%和0.66%～1.85%;以图2中的10号峰为参照峰，测得HPLC－ELSD图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.91%～2.77%和1.02%～2.94%，表明仪器的精密度良好。

2.1.2 重复性试验 取同一黑茶样品5份，按1.3平行制备，在1.2的色谱条件下分别进样分析，按照与2.1.1相同的图谱数据处理方法，测得HPLC－DAD图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.17%～1.35%和0.89%～2.45%;HPLC－ELSD图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.88%～2.81%和0.94%～2.82%，表明该提取方法的重复性良好。

2.1.3 稳定性试验 取同一份黑茶样品按1.3制备，分别在0、2、4、8、12、16、20、24h 不同时间点，按 1.2的色谱条件进样分析，按照与2.1.1相同的图谱数据处理方法，测得HPLC－DAD图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.88%～2.24%和1.38%～2.73%，HPLC－ELSD图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为1.23%～2.88%和1.54%～2.96%，表明样品提取液在24h内稳定。

2.2 ELSD检测参数的优化

2.2.1 漂移管温度的选择 漂移管温度影响ELSD的响应，当漂移管温度较低时溶剂挥发不完全，背景噪声较大，随着温度的升高流动相蒸发趋于完全，信噪比增加，但温度过高时可能会导致待测组分的部分汽化，有效信号响应值变小［18］。该试验在固定雾化气体流速及不分流模式下，考察了漂移管温度分别为90、95、100、105、110、115、120℃时对各组分峰响应值的影响，结果表明，随着温度的升高，大部分组分峰的ELSD响应值增大，当温度达到105℃后，随着温度的升高响应值变化不明显，当温度为110℃时基线平稳，峰形较好。由于该实验在进行梯度洗脱时有机相的起始浓度较低，为保证高水相流动相的蒸发，该实验最终选择110℃的漂移管温度。

2.2.2 雾化气体流速的选择 雾化气体流速影响雾化器中液滴的形成，从而影响ELSD的响应［19］。该试验用空气作为载气，在漂移管温度为110℃和不分流模式下，考察了 0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0L/min的不同流速水平，结果表明，当流速较低时，背景噪声较大，基线不稳定，随着流速的增加，信噪比升高，当流速为2.8L/min时基线趋于平稳，黑茶中各组分的响应值较好，在此基础上再继续增大流速时响应值逐渐降低，这是由于流速过大时气溶胶液滴变小，造成信号响应值的下降。

2.3 我国黑茶HPLC－DAD和HPLC－ELSD指纹图谱的建立

测定了我国6个黑茶主产地的18个不同厂家的36个黑茶样品，所得的HPLC－DAD指纹图谱见图3，HPLC－ELSD指纹图谱见图4。分别计算36个黑茶样品的HPLC－DAD和HPLC－ELSD图谱中各组分峰的相对保留时间。将各组分峰按相对保留时间一一匹配后36个黑茶样品的HPLC－DAD色谱图中共确定27个共有峰，各共有峰的平均相对保留时间见表2;36个黑茶样品的HPLC－ELSD色谱图中共确定15个共有峰，各共有峰的平均相对保留时间见表3。HPLC－DAD 指纹图谱共有模式中的5、10、11、13、14、15、16、19号共有峰经与对照品(图5)比较，分别确定为没食子酸(tR=13.447min)、表没食子儿茶素(EGC)(tR=24.720min)、儿茶素 (C)(tR=24.933min)、咖啡因(tR=29.517min)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)(tR=31.633min)、表儿茶素(EC)(tR=33.848min)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)(tR=35.005min)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)(tR=36.585min);HPLC－ELSD指纹图谱共有模式中的2、3、5、8、9、10 号共有峰经与对照品(图 6)比较，分别确定为谷氨酸(tR=3.549min)、L－茶氨酸(tR=7.935min)、没食子酸(tR=13.543min)、EGC(tR=24.818min)、EC(tR=33.946min)、ECG(tR=36.683min)。儿茶素(C)、EGCG、GCG在云南黑茶中含量很低，因此用ELSD在云南黑茶中基本检测不到上述成分，故在建立我国黑茶的HPLC－ELSD指纹图谱时将其剔除;咖啡因属于半挥发性物质，有较强的紫外吸收，由于该试验采用的ELSD漂移管温度较高，空气流量较大，咖啡因在该试验条件下在ELSD中无响应。L－茶氨酸又称N－乙基－γ－L－谷氨酰胺，为茶属植物中的特征性非蛋白质氨基酸［20］;谷氨酸也是茶叶中含量较大的氨基酸［21］，这两种组分仅在ELSD中有响应。各黑茶样品的色谱图中共有峰面积占总峰面积的比例均在90%以上。

图3 我国不同产地黑茶的HPLC－DAD指纹图谱Fig.3 The HPLC－DAD fingerprinting of dark teas from different regions in China

图4 我国不同产地黑茶的HPLC－ELSD指纹图谱Fig.4 The HPLC－ELSD fingerprinting of dark teas from different regions in China

图5 混合对照品的HPLC－DAD图谱Fig.5 The HPLC－DAD chromatogram of mixed reference substances

图6 混合对照品的HPLC－ELSD图谱Fig.6 The HPLC－ELSD chromatogram of mixed reference substances

表2 我国不同产地黑茶样品HPLC－DAD共有峰的平均相对保留时间Table 2 The average relative retention time of HPLC－DAD common peaks of dark teas from different regions in China

表3 我国不同产地黑茶样品HPLC－ELSD共有峰的平均相对保留时间Table 3 The average relative retention time of HPLC－ELSD common peaks of dark teas from different regions in China

2.4 同源峰分析

由同一化合物激发的、分别展示在 DAD和ELSD图谱中的一对色谱峰称为同源峰［22］，黑茶中的一些化合物能同时激发DAD和ELSD响应，但由于柱洗脱液是先后流入DAD和ELSD，因此同一化合物的保留时间在ELSD中会有一定的滞后，但同源峰保留时间的差值仅与两检测器间管路的死体积及流动相流速有关，可据此进行同源峰的识别。取没食子酸对照品溶液连续进样6次，测定结果表明同源峰保留时间的滞后值为0.096±0.002min，考察黑茶样品HPLCDAD和HPLC－ELSD指纹图谱共有模式中各共有峰的保留时间，共识别出8对同源峰，见表4。

表4 黑茶样品中的同源峰Table 4 The peaks of the same chemical compound of dark tea samples

2.5 相似度评价

应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)软件分别计算36个黑茶样品及对照茶样的HPLC－DAD和HPLC－ELSD图谱与各自指纹图谱共有模式的相似度，见表5。结果表明，36个黑茶样品与黑茶HPLC－DAD指纹图谱共有模式的相似度在0.903～0.979之间，与黑茶HPLC－ELSD指纹图谱共有模式的相似度在0.902～0.974之间，相似度均大于0.900，说明它们所含的化学成分较相似。6个对照茶样与黑茶HPLC－DAD指纹图谱共有模式的相似度在0.545～0.835之间，与黑茶 HPLC－ELSD指纹图谱共有模式的相似度在0.595～0.849之间，相似度较低;从图7和图8也可以看出黑茶与其它6个对照茶样的谱图有明显差异。滇红属于全发酵茶，与黑茶较接近，从相似度结果可以看出，相比于其它对照茶样，滇红与黑茶指纹图谱共有模式的相似度最高。

图7 黑茶与对照茶样的HPLC－DAD色谱图Fig.7 The HPLC－DAD chromatogram of dark tea and the control tea samples

3 结论

图8 黑茶与对照茶样的HPLC－ELSD色谱图Fig.8 The HPLC－ELSD chromatogram of dark tea and the control tea samples

该实验利用HPLC－DAD－ELSD联用技术建立了我国不同产地黑茶的HPLC－DAD－ELSD指纹图谱，36个黑茶样品的HPLC－DAD色谱图中共确定27个共有峰，鉴别了8种组分，参照峰为咖啡因;HPLCELSD色谱图中共确定15个共有峰，鉴别了6种组分，参照峰为ECG。该试验利用DAD和ELSD分别获取了互不相像的图谱，说明两者可提供不同的、互补的信息;黑茶中的一些化合物可同时被DAD和ELSD检测到，产生一对同源峰，该试验共识别出8对同源峰;相似度分析结果表明我国不同产地黑茶样品间主要色谱峰的整体图貌基本一致。该试验所建立的黑茶HPLC－DAD－ELSD指纹图谱更全面地反映了我国黑茶中非挥发性成分的化学特征，能为我国黑茶的鉴别和质量评价提供有益参考。

表5 不同茶样与黑茶指纹图谱共有模式的相似度分析Table 5 Similarity analysis between different tea samples and the fingerprinting common pattern of dark teas

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