DC－CIK细胞免疫疗法对卵巢癌患者免疫功能的影响及临床意义

李新迪，孟凡旭，王 欣，刘 念，刘林林

DC－CIK细胞免疫疗法对卵巢癌患者免疫功能的影响及临床意义

李新迪，孟凡旭，王 欣，刘 念，刘林林＊

（吉林大学第二医院放疗科，吉林长春130041）

卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，在我国，卵巢癌的死亡率高居妇科恶性肿瘤的首位，严重影响着女性的生命健康及生活质量，因而一直受到人们的关注。卵巢癌的治疗原则为手术、铂类为基础的联合化疗及放疗，但卵巢癌患者术后放化疗疗效并不十分明显，且容易复发和转移。

树突状细胞（dendritic cell，DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cell，CIK）过继性免疫治疗恶性肿瘤是一种新兴的免疫治疗手段，能有效抑制和杀灭肿瘤细胞且无明显不良反应，降低肿瘤复发及转移风险，提高患者的自身免疫力及生活质量，而且其安全性得到了广泛认可［1－6］。近年随着基础科学研究的不断进展，卵巢癌过继性细胞免疫治疗研究成为热点，它作为继手术、化疗、放疗等传统疗法之后的第四种治疗手段，患者没有明显的毒副反应，耐受性更好，生活质量的改善明显提高，在肿瘤的治疗中发挥着越来越重要的作用。本研究通过检测卵巢癌患者DC－CIK细胞免疫治疗前后外周血T淋巴细胞亚群变化及相关细胞因子变化，观察DC－CIK细胞回输对卵巢癌患者免疫功能的影响，为进一步阐明机制及优化临床应用进行初步探讨。

1 资料与方法

1．1 研究对象 入选标准及对象：收集2009年3月－2012年3月就诊于吉林大学白求恩第二医院肿瘤生物治疗中心单纯行DC－CIK细胞免疫治疗的卵巢癌患者22例，所有患者行DC－CIK细胞免疫治疗时间至少为末次治疗（手术、放疗或化疗）后8周，既往未接受过细胞免疫治疗；患者KPS评分≥60分，预期生存＞3个月；同时排除其他系统和器官的恶性肿瘤、急慢性感染性疾病、自身免疫病及糖尿病等疾病，见表1。

表1 22例卵巢癌患者临床资料［n（%）］

患者排除标准：心、肝、肾功能不全；并发其他恶性肿瘤；有精神或心理疾病不能配合治疗及疗效评估者。

1．2 主要仪器与试剂

血细胞分离机（德国Kabi Fresenius公司），Ficoll－Hypaque（美国Gibco公司），FC500流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），抗人IL－2、INF－γ、TNF－αELISA试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司），酶联免疫酶标仪（美国Themro公司）。

1．3 DC－CIK细胞的制备，参照文献［7］

1．4 治疗方法

对入组患者详细了解病史，22例患者中浆液性癌17例，黏液性癌5例。Ⅰ期4例，Ⅱ期5例、Ⅲ期8例、Ⅳ期5例，患者年龄（60－76）岁，中位年龄65岁。全部患者距末次治疗（手术或放、化疗）均超过8周，KPS评分≥60分，预期生存＞3个月。

入组患者每周期治疗前7天采集外周血单个核细胞，细胞于实验室进行培养，第8天开始行DCCIK细胞回输（1×109CIK及1×107DC细胞用0．9%生理盐水100ml制成悬液，静脉输注，1h内输完，交替输注一次共7次）。所有患者均为4－6周行1次DC－CIK细胞免疫治疗，每名患者共行7周期治疗。输注细胞过程中密切监测患者生命体征，随访48h观察患者的短期不良反应。

1．5 样品采集

分别于第1周期单个核细胞采集当天、第3、第7周期治疗结束后第7天采集患者外周血，分别用CD3、CD4、CD8、CD56进行荧光标记，进行T细胞亚群的检测。

1．6 细胞因子测定

采用ELISA法检测患者血清TNF－α、IL－2、INF－γ的表达水平，按试剂盒说明书操作。

1．7 统计学方法

采用SPSS 11．0统计软件处理，数据采用_x±s表示，各组样本治疗前后采用配对t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 治疗前后患者外周血T淋巴细胞亚群变化

在治疗前和第3、第7疗程结束后第7天分别抽取患者外周血，用美国Beckman Coulter公司FC500流式细胞仪，检测患者外周血T细胞亚群：总T淋巴细胞（CD3＋）、T辅助细胞（CD3＋／CD4＋）、T抑制细胞（CD3＋／CD8＋）、免疫状态（CD4＋／CD8＋）、自然杀伤细胞（NK细胞）（CD3－／CD16＋56＋）、NKT细胞（CD3＋／CD16＋56＋）。

经统计分析，治疗后患者T淋巴细胞亚群有增高趋势，其中辅助性T细胞亚群（CD3＋／CD4＋）、免疫功能（CD4＋／CD8＋）、NKT细胞亚群（CD3＋／CD16＋56＋）较治疗前提高幅度较明显，但无统计学差异（P＞0．05），见表2。

表2 患者外周血T细胞亚群表型变化（_x±s，%）

2．2 治疗前后患者细胞因子表达水平变化

如表3所示，患者外周血细胞因子IL－2、TNF－α、IFN－γ经3周期及7周期治疗后复查均较治疗前升高，其中7周期后复查有显著差异（P＜0．05）。

表3 患者治疗后CD4＋T细胞中相关细胞因子变化情况（_x±s，ng／L）

2．3 耐受性评估

患者经DC－CIK细胞免疫治疗后，食欲不振、疲倦乏力、失眠盗汗、情绪低落等方面明显改善。

患者治疗过程中，监测内容包括变态反应、血液系统、心血管系统、肝脏、肾脏、胃肠道、全身症状等。结果显示，在22例患者，共计154疗程的治疗过程中，5人次出现一过性发热，体温波动在37－39℃之间，经退热对症处理后缓解；2人次出现皮疹，经脱敏对症处理后消褪；3人次出现一过性心慌，但不排除输注速度过快引起。1人次出现转氨酶的升高，经对症治疗后降至正常；其他患者未出现发热、肝、肾功能异常、心脏不适和皮疹等副反应。见表4。

表4 DC－CIK细胞免疫治疗后的不良反应（n）

3 讨论

肿瘤免疫主要依赖细胞免疫，机体依赖完整的免疫机制来有效地监视和排斥癌变细胞，但癌变细胞因某些原因逃避免疫的监视排斥而增殖到一定程度时，肿瘤的发生便不可避免。因而机体细胞免疫功能的低下往往是肿瘤难以治愈和容易复发转移的重要原因。肿瘤的免疫治疗正是针对患者机体免疫力低下，针对性治疗肿瘤的手段，是继手术、化疗、放疗后肿瘤治疗的第4种模式。而过继性细胞免疫治疗是肿瘤生物免疫治疗中的重要手段，其宗旨在于通过提高机体的肿瘤抗原识别能力和免疫介导的肿瘤杀伤能力，从而打破患者的免疫耐受和免疫抑制状态，起到延缓或减少肿瘤复发，提高肿瘤的治愈率和患者生存率的作用［8］。

DC和CIK是目前肿瘤过继性细胞免疫治疗中应用较为广泛的细胞。DC发现于1973年，是目前发现功能最强大的专职性抗原提呈细胞，能够摄取并识别肿瘤相关抗原，再将抗原递呈给T淋巴细胞，有效诱导初始及静息的T淋巴细胞增值和应答［9］，在机体的免疫应答以及抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。CIK是迄今发现的所有免疫效应细胞中，增殖能力最强、细胞毒活性较强的细胞，其具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，同时还具有NK细胞非MHC限制性的抗肿瘤活性。DC、CIK二种细胞的联合应用，确保了一个高效的免疫反应［10］，有效的杀伤肿瘤［11］。其主要机制目前认为主要有以下3个方面［12－14］：①通过不同的机制识别肿瘤细胞后，释放穿孔素、颗粒酶等毒性颗粒，直接裂解肿瘤细胞。②可以释放大量具有抑（杀）瘤活性的细胞因子，如IFN－γ、IL－2、INF－α，从而直接抑制肿瘤细胞并通过调节机体免疫反应性对肿瘤细胞进行杀伤。③CIK细胞还可以通过表达II型跨膜糖蛋白诱导肿瘤细胞凋亡。CIK细胞免疫治疗恶性肿瘤在国内很多医院已经开展，以CIK细胞为基础的过继性免疫治疗是近几年肿瘤生物免疫治疗领域的热点和焦点，并于胃肠道恶性肿瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌等多种恶性肿瘤病例中得到研究应用，取得了显著的疗效。但众所周知，抗肿瘤的细胞免疫是一个相当复杂的过程，T细胞亚群数量及相应细胞因子的变化的动态观测可为过继疗法的优化应用及机制探讨提供重要的基础数据。

本研究通过对卵巢癌患者外周血淋巴细胞亚群及相关细胞因子的分析发现，DC－CIK细胞免疫治疗后，患者外周血辅助性T细胞亚群（CD3＋／CD4＋）、免疫功能（CD4＋／CD8＋）、NKT细胞亚群（CD3＋／CD16＋56＋）与治疗前相比，均有所升高，但无显著统计学差异（P＞0．05），CD3＋／CD4＋、CD4＋／CD8＋、CD3＋／CD16＋56＋比值增加表明机体细胞免疫功能增强，提示DC－CIK细胞治疗能增强机体的免疫功能，患者免疫抑制状态得到了最大程度地改善，进一步杀伤肿瘤细胞。

正常的生理情况下，Th1、Th2两类辅助性Th细胞处于相互抑制、相互转化的平衡状态，一旦平衡被打破，机体就会处于Th1优势或Th2优势的漂移状态，从而出现各种病理反应。卵巢癌患者处于免疫抑制状态，免疫功能越低，漂移越强［15］，在抗肿瘤免疫中，Th1类细胞因子应具有更重要的作用，有报道称［16］，肿瘤患者Th2较Th1相对存在优势，这可能与肿瘤免疫的抑制相关。Th1细胞主要分泌IL－2、IFN－γ、TNF－α和TNF－β。CIK可特异地聚集于肿瘤局部发挥靶向抗肿瘤作用；分泌大量的Th1类细胞因子［17］，有研究显示，DC－CIK联合治疗可增加IFN－γ的表达，进一步增强抗肿瘤作用。本研究结果提示，患者外周血IL－2、TNF－α、IFN－γ水平较治疗前提高且差异均有统计学意义（P＜0．05），提示DC－CIK细胞免疫治疗有助于患者机体Th1免疫增强，提高机体抗肿瘤能力。有研究显示，DC的CD40可以和CIK细胞表面的CD40配体接触并相互作用，从而促进DC共刺激分子和特异性分子的表达，使DC分泌的细胞因子（如IL－2、IL－12、IFN－γ等）明显增多，刺激CIK 细胞的增殖活性［18，19］，促进CIK细胞成熟，而CIK细胞活化后可以产生大量的炎症细胞因子，如IL－2、IFN－γ、TNF－α等，进一步抑制肿瘤、杀伤肿瘤细胞。同时值得注意的是，一些表面标志物与患者预后密切相关，其可能同样在免疫治疗疗效发挥中起到了关键作用，并有可能是未来过继性免疫治疗的发展方向［20，21］。

综上所述，DC－CIK细胞治疗能有效地提高卵巢癌患者的T淋巴细胞免疫能力并增强Th1类细胞因子抗肿瘤作用，有效提高患者生存质量，且安全性良好。随着细胞免疫学、分子生物学及基因工程技术的发展，相信过继性细胞免疫治疗将在抗肿瘤治疗中发挥更大的作用。

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李新迪（1987－），男，在读硕士，主要从事肿瘤的基因和免疫治疗研究。

2013－01－21）

1007－4287（2014）02－0283－04

＊通讯作者