多发性硬化患者外周血CD4及共刺激分子CD28表达变化

谭纳宇，杨 乐，王莹莹，万 超，于泽洋，何金婷＊，徐忠信＊

多发性硬化患者外周血CD4及共刺激分子CD28表达变化

谭纳宇1，杨 乐2，王莹莹1，万 超1，于泽洋1，何金婷1＊，徐忠信1＊

（1．吉林大学中日联谊医院神经内科，吉林长春130033；2．吉林省人民医院内分泌科，吉林长春130021）

目的 探讨CD4和CD28在多发性硬化患者中的表达变化。方法 采用流式细胞术检测29例多发性硬化患者外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋的表达变化，采用EDSS量表对MS患者进行神经功能损伤评分。结果 复发期MS患者CD4＋表达明显高于缓解期MS和对照组，缓解期MS患者外周CD4＋细胞明显表达高于对照组；复发期MS患者CD28＋表达明显低于缓解期，缓解期明显低于对照组；CD4＋CD28＋三组比较无统计学差异；重度MS患者外周血CD4＋表达高于中度，重度MS患者外周血CD28＋表达低于中度，而CD4＋CD28＋表达二组比较无统计学差异。结论 多发性硬化患者CD4＋表达水平升高，CD28＋表达水平降低，CD28＋可能促进CD4＋T淋巴细胞活化。

多发性硬化T细胞CD4CD28

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0210）

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是临床较常见的中枢神经系统自身免疫性疾病，但其确切发病机制尚未完全明确。研究表明CD4、CD8T淋巴细胞、小胶质细胞和巨噬细胞均参与 MS炎性反应［1］，大量研究提出了体液免疫、病毒感染、遗传倾向、环境因素及个体易感因素综合作用的多因素病因学说。近年研究发现，血液中CD4＋T细胞亚群的大量诱导及其对病灶部位的主动入侵，均能加速诱发组织损伤，CD28是激发T细胞反应的重要分子。本研究对MS患者CD4T淋巴细胞及CD28的表达进行检测，同时采用EDSS量表对MS患者进行功能评分，观察MS患者CD4、CD28表达与MS患者病情复发缓解的关系，以期对MS患者病情严重程度监测起到一定的指导意义。

1 资料与方法

1．1 一般资料

全部病例来自吉林大学中日联谊医院神经内科患者。MS患者均符合Poser诊断标准［2］，所有患者均为临床确诊的复发缓解型MS，共计29例，其中男6例，女23例，年龄18－61岁，平均36．6± 10．5，病程5个月至11年，复发次数1－7次。

1．2 研究对象及分组

所有MS患者及对照组均无其他自身免疫病、组织损伤、肿瘤、遗传变性疾病，其中MS复发组：19例，MS缓解组：10例，对照组：18例为同期健康体检者。以上各组间性别及年龄分布无显著差异性。

1．3 EDSS功能评分

多发性硬化伤残功能采用EDSS评分（Kurtzke标准）［3］。据MS患者病损程度分类，中度（1－5分）13例，重度（5分以上）16例。

1．4 CD4＋、CD28＋及CD4＋CD28＋检测

单克隆抗体分别为CD4－PE为藻红蛋白荧光素标记和CD28－FITC为异硫氰荧光素标记，够自法国Immunotech公司，检测方法为流式细胞术（美国Beckman－Coulter ELITE型流式细胞仪）

血液样本用EDTA抗凝管抽取，收集静脉血3 ml，在测定管中加入全血100μl，避光30min、溶血10min裂解红细胞、然后加入不同荧光素标记的anti－CD4，CD28的抗体，室温下混匀，离心（1 000 rpm，10min）、PBS 1．0ml（0．1MpH7．4）洗涤、离心（1 500rpm，5min）、弃上清、加0．6ml PBS（0．1MPH7．4），上机检测分析。

1．5 统计学方法

采用SPSS16．0软件包处理，计量资料以_x±s表示，多组之间均数比较采用t检验。

2 结果

2．1 患者外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表达变化

复发期、缓解期、对照组CD4＋表达水平分别为50．62±8．42、37．91±7．45、30．68±7．29，CD8＋表达水平分别为42．22±6．29、49．38±7．52、54．79± 7．43，CD4＋CD28＋，20．34±5．63、22．46±5．87、23．15±6．59。结果表明，复发期MS患者CD4＋表达水平高于缓解期MS患者和对照组，有统计学差异（P＜0．05），缓解期CD4＋表达水平高于对照组。复发期CD28＋表达水平低于缓解期MS和对照组（P＜0．05），缓解期CD28＋表达水平亦低于对照组（P＜0．05），三组CD4＋CD28＋表达水平无统计学差异（P＞0．05），见图1。

图1 MS患者外周血CD4＋、CD28、CD4＋CD28＋表达变化（%）

2．2 不同病情严重程度患者外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表达变化

外周血CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表达，EDSS中度分别为47．67±6．42 49．27±8．32 22．13 ±5．87，EDSS重度度分别为54．54±6．79、42．76± 7．64、24．24±6．56。结果表明，重度患者CD4＋表达水平高于中度（P＜0．05），重度患者CD28＋表达水平低于中度（P＜0．05），二组CD4＋CD28＋表达水平比较无统计学差异（P＞0．05），见图2。

图2 不同病损程度MS患者CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋表达变化（%）

2．3 患者CD4＋和CD28＋表达相关性分析

相关分析显示，多发性硬化患者CD4＋表达水平与CD28＋表达水平具有正相关性，r＝0．77（P＜0．01）。

3 讨论

多发性硬化（MS）是以中枢神经系统白质脱髓鞘病变为特点，遗传易感个体与环境因素作用发生的自身免疫性疾病。研究发现，患有多发性硬化症的患者脑和脊髓中出现持久的组织损伤可能是由于误导的杀伤性T细胞失去控制所致。MS是以神经纤维髓鞘损伤和轴突破坏、电脉冲传导性减弱、分散投射为特点的炎性病变［4］。MS被认为是人体的正常防御病原体机制的崩塌因而出现自我攻击，由于T细胞识别来源于病原体，髓鞘或其它来源的的蛋白质，需要其他细胞将目标蛋白质分解成称为肽的小片段，然后在特定的分子包将肽段递呈给T细胞［5］，并已确定参与MS的病理过程中递呈髓鞘蛋白的T细胞即CD4＋T细胞在MS的髓鞘损伤中发挥了重要的作用，在人类MS在动物模型的实验性自身免疫性脑炎中，CD4＋T细胞在炎症反应中占有显著的比例。在T淋巴细胞的激活过程中，如没有共刺激信号存在，T细胞呈无反应或免疫耐受，若共刺激信号表达状态异常，可发生自身反应性T细胞激活或自身免疫反应［6］。CD28分子是迄今为止所发现的能促使T细胞活化最重要的共刺激分子，属于免疫球蛋白超家族成员，表达于静止的CD4＋和CD8＋T细胞，与其配体结合后对免疫应答的启动、维持和下调中都起着非常重要的作用［7］。

本研究应用流式细胞术检测28例MS患者T淋巴细胞表面分子CD4＋、CD28＋、CD4＋CD28＋，结果显示，复发期MS患者CD4＋表达水平高于缓解期MS和对照组，缓解期CD4＋表达水平高于对照组，CD28＋表达水平复发期低于缓解期，缓解期低于对照组。EDSS是临床应用最普遍的多发性硬化的评估量表，也是临床试验中广泛采用的评价指标。EDSS评分以中枢神经系统八个功能系统的评价为基础，分级从正常（0分）到最严重缺损（5－6分）变化，此外，还有行动能力和日常生活限制的评定。本研究应用EDSS量表对MS患者进行伤残评分，按评分将MS患者分为中、重度，对不同病损程度MS患者外周血CD4＋及CD28＋表达水平进行了比较分析，结果显示，重度MS患者外周血CD4＋表达高于中度，重度MS患者外周血CD28＋表达低于中度，相关分析显示，CD4＋、CD28＋的表达可能与多发性硬化病情的严重程度有关。

目前关于多发性硬化治疗的目的是控制疾病的严重程度或减少复发次数以延缓神经功能损伤的进展，本研究探讨CD4＋和CD28＋等免疫细胞在MS中的作用，期待发现可能防止或控制疾病的治疗靶标或找到利用人体自身的保护机制的途径，这可能会产生具有高度特异性的治疗方法，可避免广泛的免疫抑制如糖皮质激素或氨甲喋呤等产生的副作用。

［1］Zhang X，Tao Y，Ahn M，Marcus KL，Differential Reconstitution of T Cell Subsets following Immunodepleting Treatment with Alemtuzumab（Anti－CD52Monoclonal Antibody）in Patients with Relapsing－Remitting Multiple Sclerosis［J］．J Immunol 2013，191（12）：5867．

［2］Cerosaletti K，Schneider A，Schwedhelm K，Multiple Autoimmune－Associated Variants Confer Decreased IL－2RSignaling in CD4（＋）CD25TCells of Type 1Diabetic and Multiple Sclerosis Patients．［J］．PLos One，2013，8（12）：83811．

［3］Trinschek B，Lussi F，Haas J，Wildemann B，Kinetics of IL－6production defines T effector cell responsiveness to regulatory T cells in multiple sclerosis［J］．PLos One 2013 14；8（10）：7634．

［4］Buntinx M，Ameloot M，Steels P，et al．Interferon－gamma－induced calcium influx in T lymphocytes of multiple sclerosis and rheumatoid arthritis patients：a complementary mechanismcelactivation［J］．Neuroimmunol，2005，124（1，2）：70．

［5］Leary SM，Thompson AJ，primary progressive mutiple scerosis：cur－－rent and future treatment options．CNS Drugs［J］．2005，19（5）：369．

［6］CamperioC，Muscolini M，Volpe E，Di Mitri D，CD28ligation in the absence of TCR stimulation up－regulates IL－17Aand pro－inflammatory cytokines in relapsing－remitting multiple sclerosis T lymphocytes［J］．Immunol letter．2014，78（14）：2．

［7］Killestein J，Polman CH．Current trials in mutiple sclerosis：established evidence and future hopes［J］．Curropin Neurol，2005，18（3）：253．

Expression of CD4 and CD28 costimulatory molecules of Multiple sclerosis

TAN Na－yu，YANG Le，WANG Ying－ying，et al．
（Department of Neurology，China－Japan Union Hospital of Jilin University，Jilin130033，China）

Objective To investigate the expression of multiple sclerosis patients with CD4Tlymphocytes and CD28 costimulatory molecules．Methods Flow cytometry was used in 28patients with MS peripheral blood T lymphocytes CD4＋，CD28＋，CD4＋CD28＋were detected，and the application for MS patients with EDSS disability scale score．Results Relapse of MS patients with CD4＋remission of MS was higher than the control group，remission MS patients with peripheral CD4＋cells expressed higher；relapsed CD28＋peripheral blood of MS patients was lower than in remission，remission than the control group；CD4＋CD28＋three groups showed no significant differences；severe MS patients was higher than in peripheral blood CD4＋moderate，severe peripheral blood CD28＋MS patients was lower than moderate，and CD4＋CD28＋expression of the two groups showed no significant difference．Conclusion Patients with multiple sclerosis accompanied by increased expression of CD4＋with CD28＋expression of costimulatory molecules reduced costimulatory molecules CD28＋lymphocytes in abnormal activation plays an important role，CD28expression abnormalities may also be involved in its pathogenesis．

Multiple sclerosis；T lymphocytes；CD4；CD28

R744．5＋1

A

谭纳宇，女，在读硕士，主要从事临床神经病学。

2013－02－28）

1007－4287（2014）02－0210－03

＊通讯作者