湖北海棠叶水煎剂对HSV-1病毒性结膜炎治疗作用

李祖铭,孔丽华,余玲,王青,黄朝明,席祖莲,屈克义,李建蓉

(1.湖北省宜昌市夷陵区妇幼保健院,宜昌 443100;2.湖北省宜昌市夷陵医院,宜昌 443100;3.华中科技大学同济医学院病原生物学系,武汉 430030)

湖北海棠叶水煎剂对HSV-1病毒性结膜炎治疗作用

李祖铭1,孔丽华1,余玲1,王青1,黄朝明1,席祖莲2,屈克义2,李建蓉3

(1.湖北省宜昌市夷陵区妇幼保健院,宜昌 443100;2.湖北省宜昌市夷陵医院,宜昌 443100;3.华中科技大学同济医学院病原生物学系,武汉 430030)

目的 研究湖北海棠叶水煎剂对I型单纯疱疹病毒(HSV-1)所致结膜炎的治疗作用。方法采用湖北海棠叶水煎剂作为实验样品,用利巴韦林滴眼剂作对照。分别以HSV-1感染Vero细胞和家兔眼结膜,通过观察细胞病变效应判断药物抑制病毒复制的环节。对家兔眼结膜炎疾病模型进行眼结膜组织病理学检查,观察低、中、高浓度湖北海棠叶水煎剂对HSV-1兔眼结膜炎的治疗作用。结果体外实验中,湖北海棠叶水煎剂对HSV-1增殖无抑制作用。整体动物实验中,眼部给予湖北海棠叶水煎剂3,6 kg·L-1,连续给药7 d,家兔眼结膜病理性炎症反应明显减弱甚至消失,与0.9%氯化钠溶液对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。中、高剂量组家兔眼结膜炎治疗有效率分别为83.3%和100.0%。结论湖北海棠叶水煎剂可减轻HSV-1所致家兔结膜炎炎性反应。

湖北海棠叶;结膜炎,病毒性;抗病毒作用

结膜炎是眼科常见病,结膜炎的病因主要分为感染性和非感染性,而感染性结膜炎的病原体主要包括病毒、细菌和衣原体等。湖北海棠含有茶多酚、黄酮、锌(Zn)、镉(Cr)、锰(Mn)等多种矿物质,具有抗菌消炎、耐缺氧、抗疲劳、降血糖等多种药理作用[1-2]。湖北宜昌民间常用湖北海棠叶煎液治疗急性结膜炎,笔者前期研究发现,湖北海棠叶煎液具有一定的抗菌作用,在此基础上,笔者在本实验将进一步探讨湖北海棠叶对I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1, HSV-1)所致病毒性结膜炎的治疗效果,以期为该药的开发、应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试药 湖北海棠叶(采自湖北省宜昌市夷陵区,经宜昌市夷陵医院李文胜主任药师鉴定为蔷薇科植物湖北海棠Malus hupehensis),称取新鲜干燥湖北海棠叶1,3,6 kg,分别用纯化水2 L浸泡24 h,煎煮,过滤,去渣,浓缩至100 mL,相当各生药含量为1,3, 6 kg·L-1水煎剂,置冰箱内供实验用。利巴韦林滴眼液(武汉五景药业有限公司生产,利巴韦林含量1 g·L-1,批号:12030701)。达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's MediumDMEM,赛默飞世尔生物化学制品有限公司);胰酶(美国Gibco公司);噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazoliumbromide,MTT,美国Biosharp公司)等。

1.2 仪器 二氧化碳(CO2)培养箱(力康生物医疗有限公司),二级生物安全柜(新加坡ESCO),倒置显微镜(日本奥林巴斯),酶标仪(美国THERMO)等。

1.3 实验用病毒及其活力测定 HSV-1由武汉大学医学院医学病毒研究所提供,由华中科技大学同济医学院病原生物学系传代后低温保存,备用。细胞株: Vero细胞由中国医学科学院病毒研究所提供;病毒滴度的测定:将不同浓度的各病毒液接种于相应的单层细胞培养物中,测定引起50%细胞病变的组织细胞感染剂量(50%tissue culture-infective dose,TCID50)[3]。Vero细胞接种HSV-1后50 h出现圆缩、死亡和脱落等细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)。

1.4 细胞毒性测定 正常对照组:加等量不含任何药物细胞维持液;药物处理组:分别将1×108·L-1Vero细胞悬液接种于96孔细胞培养板,每孔100 μL,37℃CO2培养箱培养20～24 h,生长成单层细胞,弃培养液,分别加入含不同浓度(终浓度分别为0.5,1,2,4, 8,16,32,64,128,256 g·L-1)湖北海棠叶水煎剂及利巴韦林的细胞维持液200 μL,阳性药对照组:利巴韦林终浓度分别为0.5,1,2,4,8,16,32,64,128, 256 mg·L-1,各10个浓度梯度。各浓度实验药,对照药及正常细胞对照均设复孔3个。培养72 h后,观察CPE情况;并用MTT比色法检测细胞活性,计算存活细胞百分比[4]。按Reed-Meuench法计算药物对细胞的半数毒性浓度(50%Cytotoxic concentration,CC50,单位:g·L-1)[5]。

1.5 体外抗病毒实验 将100个TCID50/mL滴度的病毒与上述各浓度的湖北海棠叶煎剂4℃作用6 h,反应体系为200 μL,即100 μL的TCID50100个·mL-1滴度的病毒和100 μL的药物,然后将混合液放于单层细胞,孵育2 h,换用细胞维持液继续细胞生长。37℃CO2培养箱继续培养3 d,每天连续观察CPE。按文献[6]计算存活细胞的百分比及药物抗病毒半数有效浓度(effective concentration,EC50)。

1.6 实验动物与病毒性眼结膜炎模型的制备 普通级新西兰家兔,体质量2.0～2.5 kg,30只(60只眼),雌雄各半,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,动物使用许可证号:SYXK(鄂)2012-0028。兔眼结膜炎的制备:在家兔双眼内滴2%利多卡因表面麻醉后,在上眼睑结膜表面作“#”划痕,取1∶5稀释的HSV-1液[该浓度比是引起100%家兔眼结膜病变的最低剂量,100%最低光毒性剂量(minimal phototoxic dose,MPD)]100 μL接种于划痕处,轻揉眼睑1 min,将兔放置兔笼内正常喂养,每天定时观察家兔眼结膜病变并记录。

1.7 动物分组及药物处理 成年健康家兔30只,雌雄各半,采用随机数字表法进行完全随机化分组,共分为5组,即病毒感染模型对照组,病毒感染+湖北海棠叶水煎剂3个剂量组,阳性对照组,每组6只。除模型对照组外,其他各组兔眼在病毒感染后24 h分别双眼内滴入海棠叶水煎剂(浓度为1,3,6 kg·L-1)或利巴韦林滴眼剂50 μL,病毒感染模型对照组兔眼滴入等量灭菌0.9%氯化钠溶液,以上各组动物每天用药2次,连续给药7 d。用药期间每天观察兔眼病情,根据文献按结膜充血和水肿等临床症状将病情分为轻、中、重3级[7]。实验结束后分别取各组家兔双眼睑组织,用10%甲醛固定后切片,苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,进行病理学检查。根据病理检查评价药物的疗效,结果判定为治愈、显效、改善、无效。

1.8 统计学方法 用SAS6.12统计软件处理,组间差异显著性比较采用Χ2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外抗病毒作用 正常对照组细胞无CPE, 100TCID50浓度的病毒作用细胞后约3 d出现明显CPE。在无细胞毒浓度范围内将湖北海棠叶水煎剂进行倍比稀释,MTT法检测其对HSV-1引起的细胞病变的抑制。湖北海棠叶水煎剂不同浓度组均出现典型病毒感染所致的CPE,且与病毒对照孔无显著区别,表明湖北海棠叶无直接杀灭病毒作用。在抑制病毒生物合成实验中,湖北海棠叶无明显抑制HSV-1在细胞内生物合成作用。

2.2 对HSV-1兔眼结膜炎的治疗作用 抗HSV-1病毒性结膜炎实验结果见表1。HSV-1感染后,模型对照组6只兔(12只眼),其中10只眼发生明显的炎症反应,2只眼发生中度改变,经湖北海棠叶水煎剂(1,3, 6 kg·L-1)处理后,病变程度明显减轻,有效率分别为50.0%,83.3%,100.0%,疗效与剂量之间存在一定的量效关系,在模型对照组可观察到家兔结膜充血、水肿明显,7 d后50%可自愈。湖北海棠叶水煎剂低剂量组的疗效与模型对照组相当,差异无统计学意义(P＞0.05),而中剂量组和高剂量组治愈率分别为83.3%,100.0%,与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),高剂量组的疗效略优于阳性对照组。结果见表1。

2.3 对HSV-1兔眼结膜组织病理形态学的影响 见图1。未感染HSV-1家兔仅局部眼结膜可见少量淋巴细胞及嗜酸粒细胞,HSV-1感染家兔结膜炎主要表现为大量淋巴细胞浸润,淋巴滤泡形成,经湖北海棠叶水煎剂滴眼治疗显效的HSV-1感染家兔结膜炎标本炎性细胞浸润,血管充血和组织水肿均有显著改善。

3 讨论

湖北海棠又名野海棠、野花红、花红茶、茶海棠,属蔷薇科苹果属落叶乔木,其嫩叶晒干可作茶叶饮用。湖北海棠有抗植物病毒的作用,其中的黄酮类化合物抗病毒活性较强,根皮苷是湖北海棠的主要成分,也有抗病毒作用[8]。目前临床用于预防或治疗病毒性眼结膜炎的药物主要为抗菌药物和抗病毒药物,近几年应用以中药为原料的防治病毒性眼结膜炎药物也有较多报道,并且在治疗单纯疱疹病毒感染性疾病已取得较好疗效。

HSV-1感染正常家兔眼结膜后,可制备出实验性家兔眼结膜炎模型。HSV-1感染家兔眼结膜主要病理变化为淋巴细胞浸润,淋巴滤泡的形成。而滤泡的多少与炎症反应强度呈正相关。本实验结果证实,1,3和6 kg·L-1湖北海棠叶水煎液治疗HSV-1感染实验性家兔眼结膜炎的有效率依次增高,中高剂量组疗效等于或优于利巴韦林,提示湖北海棠叶具有治疗实验性病毒结膜炎的作用。

表1 5组家兔眼结膜炎疗效结果Tab.1 Efficacy on conjunctivitis of five groups of rabbits 只

A.正常对照组;B.模型对照组;C.湖北海棠叶水煎剂高剂量组图1 3组家兔眼结膜病理切片(×100)A.normal control group;B.model control group;C.high-dose MHD-treated groupFig.1 Pathological examination on eye conjunctiva in three groups of rabbits(×100)

抗病毒的药物主要通过两个方面发挥作用,一方面抑制病毒复制(灭活、吸附、生物合成等)的各个环节,干扰病毒的生长;另一方面是提高机体免疫防御能力,减轻局部炎症反应。本实验结果显示:湖北海棠叶水煎剂对体外培养的HSV-1病毒的增殖无抑制作用,但对该病毒感染所致的结膜炎,则可明显减轻其炎症反应,减轻组织病理损伤,具有良好的治疗效果。

[1] 屈克义,胡汉环,杜远义,等.湖北海棠叶煎液药效学实验研究[J].时珍国医国药,2000,11(2):107-108.

[2] 方荣,杨茜,李莉,等.湖北海棠中根皮苷含量测定[J].食品科技,2008,6(2):195-196.

[3] FRIDHOLMH,EVERITT E.Rapid reproducible infectivity end-point titration of virulent phage in a microplate system[J].J Virol Methods,2005,128(1-2):67-71.

[4] 杨佃志,张永萍.复方大果木姜子乳膏体外抗HSV-1病毒的实验研究[J].时珍国医国药,2007,18(5):1154-1155.

[5] LIN Y J,CHANG Y C,HSIAO N W,et al.Fisetin and rutin as 3C protease inhibitors of enterovirus A71[J].J Virol Methods,2012,182(1-2):93-98.

[6] 刘莹,王国丽.金银花提取物对单纯疱疹病毒性角膜炎的作用[J].医药导报,2011,30(11):1421-1424.

[7] 葛坚.眼科学[M].北京:人民卫生出版社,2002:94.

[8] 汪鋆植,叶建武,余青,等.湖北海棠抗大蒜病毒活性研究[J].安徽农业科学,2008,36(8):3314-3315.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.006

Efficacy of Hubei Wingnut(Malus hapehensis)Leaf Decoction on Viral Conjunctivitis Infected with HSV-1

LI Zu-ming1,KONG Li-hua1,YU Ling1,WANG Qing1,HUANG Chao-ming1,XI Zu-lian2,QU Ke-yi2,LI Jianrong3
(1.Yiling Maternal and Child Health Hospital of Yichang City,Yichang 443100,China;2.Yiling Hospital of Yichang City,Yichang 443100,China;3.Department of Pathogenic Microorganism,School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of theHubeiWingnut(Malus hapehensis)leaf decoction (MHD)against conjunctivitis infected with human simplex virus type I(HSV-1).MethodsMalus hupehcnsisdecoction was used as the active treatment and ribavirin(RBV)eye drop was used as the positive control.Both of the Vero cells and rabbit eyeconjunctiva were infected with HSV-1.The effect and mechanismof the MHD on viral replication was determined by observing the cytopathic effect(CPE).The efficacy of MHD at different doses on the rabbit viral conjunctivitis was examined by pathological changes of eye conjunctiva tissues.ResultsMHD did not inhibit the proliferation of HSV-1in vitro.The inflammatory reactions of rabbit viral conjunctivitis caused by HSV-1 were obviously attenuated or disappeared after treatment with MHD at 6 kg·L-1and 3 kg·L-1for 7 consecutive days,compared with the negative control of 0.9%NaCl.The curative rate of MHD at the middle and high doses was 83.3%and 100.0%,respectively.ConclusionMHD has the potential for treating eye conjunctivitis caused by HSV-1 by relieving inflammation.

HubeiWingnut(Malus hapehensis)leaf;Conjunctivitis,viral;Anti-viral effect

R285.5;R965

A

1004-0781(2014)07-0862-04

2013-06-24

2013-08-20

李祖铭(1971-),男,湖北宜昌人,副主任技师,学士,主要研究方向:临床病原体实验室诊断。E-mail: lizumingyichang@126.com。

孔丽华(1967-),女,湖北宜昌人,副主任医师,学士,主要研究方向:儿童微生物检验。E-mail:klhycyl@126. com。