西他沙星溶解度与表观油水分配系数研究*

丁维明,李桂玲,蔡聪,王菊仙,杨信怡

(中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所,北京 100050)

·药物制剂与药品质量控制·

西他沙星溶解度与表观油水分配系数研究*

丁维明,李桂玲,蔡聪,王菊仙,杨信怡

(中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所,北京 100050)

目的 测定西他沙星在不同溶剂中的溶解度以及表观油水分配系数,为剂型研究和制备工艺提供依据。方法采用高效液相色谱(HPLC)法,Dikma Diamonsil C18(2)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至2.4)∶乙腈=70∶30;柱温:室温;流速1.0 mL·min-1;检测波长:295 nm;进样量10 μL。考察西他沙星在pH为2.0,4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0,11.2磷酸盐缓冲液中溶解度和表观油水分配系数。结果在(37±2)℃条件下,西他沙星在水中的平衡溶解度为0.44 mg·mL-1,表观油水分配系数(P)为0.23(lgP= -0.64);在不同pH磷酸盐缓冲液中,西他沙星在pH 7.4的中性条件下溶解度最低,仅为0.13 mg·mL-1,表观油水分配系数最大,在pH＞10及pH＜5.8,西他沙星平衡溶解度显著增大,表观油水分配系数相应减小。结论西他沙星难溶于水,脂溶性也较差,但在酸性和碱性条件下有较高的溶解度。

西他沙星;溶解度;表观油水分配系数;色谱法,高效液相

西他沙星(sitafloxacin)为第4代氟喹诺酮类广谱抗菌药[1],对革兰阳性、革兰阴性和厌氧菌都具有抗菌活性,特别是对氟喹诺酮类耐药菌株、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、青霉素不敏感肺炎链球菌、肠球菌也具有抗菌作用,抗厌氧菌作用与亚胺培南、甲硝唑相当。其口服片剂和细颗粒剂已于2008年在日本上市,用于治疗敏感菌引起的各类感染以及严重难治性感染性疾病[2-5]。国内目前尚未有产品上市销售。笔者建立适用于西他沙星理化性质研究的高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法,并对方法进行验证。在此基础上,对西他沙星在水中及不同pH磷酸盐缓冲液中的溶解度和油水分配系数进行了测定,为西他沙星新型制剂的处方设计、工艺研究和稳定性考察提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(LC-20AD单元泵,CTO-20AC柱温箱,SIL-20AC自动进样器,SPD-M2A检测器,DGU-20A排气单元,LC Solution工作站,日本岛津);UV-2450紫外分光光度计(日本岛津);AE200天平[梅特勒托利多仪器(上海)有限公司];PHS-3D pH计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2 试药 西他沙星(中国医学科学院医药生物技术研究所自制,晶型为含有3/2结晶水的结晶性粉末,批号:20121023);磷酸二氢钾(分析纯,北京化工厂,批号:20120105);乙腈(色谱纯,迪马公司,批号: 122070);磷酸(分析纯,北京化工厂,批号: 20071112)。

2 方法与结果

2.1 西他沙星的HPLC方法学

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Dikma Diamonsil C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至2.4)∶乙腈=70∶30;柱温室温;流速1.0 mL·min-1;检测波长295 nm;进样量10 μL。

2.1.2 检测波长的选择 称取西他沙星适量,用流动相溶解并稀释制成浓度约为1 mg·mL-1的溶液,于波长190～400 nm进行紫外扫描,结果显示西他沙星溶液在295 nm有最大吸收,故选择295 nm作为检测波长。

2.1.3 专属性实验 称取西他沙星适量,用流动相溶解并稀释制成浓度约为0.1 mg·mL-1的溶液。按上述色谱条件进样,记录色谱图;另分别取空白溶剂(流动相)和正辛醇饱和水,按上述条件进样,记录色谱图。结果见图1,可见西他沙星主峰的峰形良好,柱效较高,且溶剂对西他沙星的测定无干扰,专属性良好。

2.1.4 重复性实验 称取西他沙星适量,用流动相溶解并稀释制成浓度约为0.1 mg·mL-1溶液,精密量取10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,量取西他沙星主峰面积,连续进样6次,考察其重复性。结果RSD为0.12%,表明方法的偏差较小,重复性较好。

2.1.5 线性关系考察 取西他沙星适量,精密称定,用流动相溶解并稀释制成1 mg·mL-1溶液,作为贮备液;分别精密量取贮备液适量,用流动相稀释制成500,200,100,50,10 μg·mL-1的系列标准溶液。分别吸取上述各标准溶液10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,量取西他沙星主峰面积,以主峰面积(A)对浓度(C,μg·mL-1)进行线性回归,得标准曲线方程:A= 49 147C-1 383.3(r=1.000,n=3)。结果表明,西他沙星在10～500 μg·mL-1浓度范围内主峰面积与浓度之间线性关系良好。

2.1.6 回收率实验 精密称取西他沙星80,100, 120 mg,分别置于100 mL量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,作为低(80%)、中(100%)、高(120%)浓度的供试品溶液。分别吸取各供试品溶液10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,量取主峰面积,按标准曲线法计算供试品溶液中西他沙星含量,计算回收率。低、中、高3种浓度回收率分别为99.7%, 100.3%,97.0%,RSD为1.4%。

2.1.7 溶液稳定性 称取西他沙星适量,用流动相溶解并稀释制成浓度约为0.1 mg·mL-1的溶液,于室温下放置,分别于0,2,4,6,8 h吸取10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,量取主峰面积,计算RSD。结果:供试品溶液于不同时间进样的主峰面积RSD为0.2%,表明西他沙星溶液在室温下放置8 h内稳定性良好。

2.1.8 检出限与定量限 配制一定浓度的西他沙星溶液,逐级稀释,分别进样10 μL,记录色谱图,计算信噪比(S/N)(主峰峰高与基线噪声的比值),以S/N≥3为检出限,S/N≥10为定量限。结果西他沙星的定量限为5.0 ng,检出限为1.5 ng。

2.2 近似溶解度 称取研成细粉的西他沙星供试品,分别置于(25±2)℃一定容量的溶剂中,每隔5 min强力振摇30 s;观察30 min内的溶解情况,如看不见溶质颗粒时,即判断为完全溶解。西他沙星在各种溶剂中的近似溶解度结果见表1。

A.空白溶剂;B.正辛醇饱和水;C.西他沙星溶液;1.西他沙星图1 西他沙星专属性实验HPLC图谱A.blank solution;B.n-octanol-saturated water;C.sitafloxacin solution;1.sitafloxacinFig.1 HPLC of specificity test on sitafloxacin

表1 西他沙星在不同溶剂中的近似溶解度Tab.1 Approximate solubility of sitafloxacin in different solvents

2.3 平衡溶解度

2.3.1 水中溶解度 称取过量的西他沙星,置具塞三角瓶中,向其中加入纯化水5 mL,平行2份,分别置于(25±2)和(37±2)℃水浴中,振摇24 h以上使平衡,得到过饱和溶液。分别取两个温度下的过饱和溶液适量,用孔径0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液10 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,量取主峰面积。按标准曲线法计算样品液浓度(即平衡溶解度)。结果西他沙星在(25±2)和(37±2)℃水中平衡溶解度分别为0.33和0.44 mg·mL-1。

2.3.2 不同pH磷酸盐缓冲液中溶解度 配制pH分别为2.0,4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0,11.2的磷酸盐缓冲液。分别称取过量的西他沙星,以不同pH的磷酸盐缓冲液为溶剂,按照上述“2.3.1”项下方法操作,计算(37±2)℃西他沙星在不同pH条件下的平衡溶解度,见图2。结果显示,西他沙星平衡溶解度在pH 7.4磷酸盐缓冲液中最低,仅为0.13 mg·mL-1,在pH＞10及pH＜5.8的条件下平衡溶解度显著增大。

图2 西他沙星在不同pH磷酸盐缓冲溶液中的平衡溶解度[(37±2)℃]Fig.2 Equilibrium solubility of sitafloxacin in different pH phosphate buffered solution[(37±2)℃]

2.4 表观油水分配系数 精密称取西他沙星适量,分别溶于正辛醇饱和的水以及被正辛醇饱和pH为2.0, 4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0,11.2的磷酸盐缓冲液中,制成浓度约为0.1 mg·mL-1溶液,分别精密量取各溶液20 mL置具塞三角瓶中,然后相应加入被水及不同pH的磷酸盐缓冲液饱和的正辛醇20 mL,充分混合,置(37±2)℃恒温振荡器中,振荡24 h以上,静置,取下层水液10 μL,注入HPLC仪,记录色谱图,量取主峰面积,按标准曲线法计算西他沙星浓度。按以下公式计算表观油水分配系数(P):

其中P为样品的正辛醇/水相分配系数;C0为初始时水相中西他沙星浓度;Cz为达平衡后水相中西他沙星浓度;V0为初始时水相体积;V为初始时正辛醇相体积。结果见表2。

表2 西他沙星在不同溶剂中的表观油水分配系数Tab.2 Apparentoil/waterpartitioncoefficientof sitafloxacin in different solvents

3 讨论

在参考相关文献[6]基础上,笔者对西他沙星的HPLC方法进行了色谱条件筛选和方法学验证。结果显示,建立的HPLC方法简便、快速、灵敏、准确,可用于西他沙星的含量测定。但在实验过程中发现西他沙星在强光照射条件下有降解产物产生,因此在溶解度和表观油水分配系数测定的实验过程中应避免强光照射。

西他沙星的临床给药剂型为口服固体制剂,而溶解度是影响其体外溶出和体内吸收的重要因素,因此测定西他沙星不同温度和不同pH条件下的溶解度,可为剂型设计和工艺参数的确定提供理论依据,对于预测制剂的溶出情况及溶出介质的选择也有一定意义。由本研究溶解度实验结果可知,西他沙星在水中溶解度极低,温度升高溶解度略有提高,但仍属极微溶。然而,随着溶液pH向酸碱两端变化,西他沙星的溶解度迅速增大,在pH 2.0酸性条件下溶解度约为pH 7.4中性条件下的425倍,在pH 11.0碱性条件下溶解度约为pH 7.4中性条件下的744倍。药物在溶剂中的溶解度是药物分子和溶剂分子间相互作用的结果,大多数药物为有机弱酸、弱碱及其盐类,这些药物受pH影响较大。有机弱酸性药物随着溶液pH升高其溶解度增大,有机弱碱类药物随着溶液pH下降而升高。西他沙星的分子结构中含有羧基和氨基基团,为两性化合物,本研究中溶解度的测定结果符合其带有酸性基团和碱性基团的特点。

油水分配系数可以反映药物在体内吸收的速度和程度,只有具备适当的油水分配系数才能使药物具有良好的吸收及较高的生物利用度。西他沙星在水中和不同pH磷酸盐缓冲液中的表观油水分配系数P均＜0,说明西他沙星的脂溶性低于水溶性;一般认为有一定的脂溶性且lgP值在-1～2范围内药物容易吸收,西他沙星在4.3＜pH＜10.0条件下lgP值在-1～2的范围内,但脂溶性较差,因此推测西他沙星在人体胃肠道内吸收度一般。但有文献报道西他沙星口服吸收良好,生物利用度可达84%～94%[1,3],对于以被动扩散机制吸收的药物来说,脂溶性大的易于透过细胞膜,由pH支配未解离的分子型药物比离子型药物易于透过细胞膜,西他沙星实际体内生物利用度要优于理论推测的结果,推测西他沙星口服吸收过程中不仅通过被动扩散透过生物膜,很可能还有主动转运的参与,具体吸收机制有待细胞水平的进一步研究。

[1] 雷妮,高嵩,陈卫东,等.西他沙星的药理和临床评价[J].中国临床研究,2010,23(10):930-932.

[2] ANDERSON D L.Sitafloxacin hydrate for bacterial infections [J].Drugs Today(Barc),2008,44(7):489-501.

[3] 柴芸,刘明亮.新氟喹诺酮类抗菌药西他沙星[J].国外医药:抗生素分册,2009,30(6):264-270.

[4] NAKASHIMA M,UEMATSU T,KOSUGE K,et al.Pharmacokinetics and tolerance of DU-6859a,a new fluoroquinolone, after single and multiple oral doses in healthy volunteers[J]. Antimicrob Agents Chemother,1995,39(1):170-174.

[5] 刘美,刘鑫荣.抗菌新药西他沙星水合物[J].上海医药, 2010,31(3):122-124.

[6] 朱光宇.HPLC法测定西他沙星的含量及有关物质[J].安徽医药,2011,15(12):1512-1513.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.028

Determination of Solubility and Apparent Oil/Water Partition Coefficient of Sitafloxacin

DING Wei-ming,LI Gui-ling,CAI Cong,WANG Ju-xian,YANG Xin-yi
(Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

ObjectiveTo determine the solubility and apparent oil/water partition coefficient of sitafloxacin in different solvents.MethodsHigh performance liquid chromatography(HPLC)was used.The column was Dikma Diamonsil C18(2) (4.6 mm×250 mm,5 μm).The mobile phase was 0.05 mol·L-1KH2PO4solution(pH was adjusted with H3PO4to 2.4)-acetonitrile(70∶30).The column temperature was set at room temperature.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 295 nm and the injection volume was 10 μL.The solubility of sitafloxacin and the apparent oil/water partition coefficient at pH 2.0,4.3,5.8,6.6,7.4,8.0,10.0 and 11.2 were determined.ResultsThe equilibrium solubility of sitafloxacin in water was 0.44 mg·mL-1and the apparent oil/water partition coefficient was 0.23(lgP=-0.64)at(37±2)℃. Sitafloxacin has the lowest equilibrium solubility(0.13 mg·mL-1)and the highest apparent oil/water partition coefficient in pH7.4 buffer solution system.At pH＞10 and pH＜5.8,the solubility of sitafloxacin increased obviously and apparent oil/water partition coefficient decreased.ConclusionSitafloxacin is insoluble in water and also poorly soluble in oil,but its solubility could be improved significantly in acidic or alkaline solution.

Sitafloxacin;Solubility;Apparent oil/water partition coefficient;Chromatography,high performance liquid

R978

B

1004-0781(2014)10-1357-04

2013-09-02

2014-02-08

*中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(IMBF201201)

丁维明(1981-),女,山东龙口人,助理研究员,硕士,研究方向:药物新剂型的研究与开发。电话:010-63181951,E-mail:weimingding@sina.com。

李桂玲(1973-),女,安徽宿州人,研究员,硕士,研究方向:药物新剂型的研究与开发。电话:010-63181951,E-mail:liguiling1999@163.com。