反相高效液相色谱法测定4-羟基-3-甲氧基苯甲酸及间苯三酚对儿茶酚氧位甲基转移酶的抑制作用

杨瑞玲,刘宏,王琪,季可菲,宋梦姣

(1.广州军区武汉总医院药剂科,武汉 430070;2.湖北中医药大学药学院,武汉 430065)

反相高效液相色谱法测定4-羟基-3-甲氧基苯甲酸及间苯三酚对儿茶酚氧位甲基转移酶的抑制作用

杨瑞玲1,2,刘宏1,王琪1,季可菲2,宋梦姣1

(1.广州军区武汉总医院药剂科,武汉 430070;2.湖北中医药大学药学院,武汉 430065)

目的 建立反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定4-羟基-3-甲氧基苯甲酸含量和观察间苯三酚对儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)的抑制作用。方法利用COMT催化3,4-二羟基苯甲酸生成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的原理,通过提取小鼠肝脏匀浆中的COMT 20 μL,在反应体系中分别加入1×10-3mol·L-1邻苯二酚及5×10-3,1×10-3,2×10-4mol·L-1间苯三酚各10 μL,利用RP-HPLC法测定产物生成量来分析间苯三酚对COMT的抑制作用。结果间苯三酚在5×10-3,1×10-3,2×10-4mol·L-13个浓度下对COMT活性均有抑制作用,抑制率分别为25.3%,17.6%,8.9%。结论间苯三酚对COMT活性具有抑制作用,但抑制作用弱于同浓度的邻苯二酚。

间苯三酚;儿茶酚氧位甲基转移酶;色谱法,高效液相,反相;抑制作用

间苯三酚(phloroglucinol)是亲肌性非阿托品类纯平滑肌解痉药,除对消化系统和泌尿系统急性痉挛性疼痛具有明显效果外,其对妇科痉挛性疼痛,如痛经亦有良好的治疗效果[1-2]。关于间苯三酚治疗痛经的机制研究,笔者未见文献报道。雌激素代谢是通过儿茶酚氧位甲基转移酶(catecholamine-O-methyl transferase,COMT)完成的,COMT活性受到抑制会造成雌激素代谢异常[3]。而雌激素与前列腺素水平呈正相关,体内前列腺素生成量增加时痛经症状加剧[4]。笔者设想间苯三酚的解痉作用与COMT的活性受到抑制有关。为了验证该设想,笔者在本研究利用COMT催化3,4-二羟基苯甲酸(3,4-dihydroxy benzoic acid,DBA)生成4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid,4-OH-3-MBA)的原理[5],利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,以COMT抑制剂邻苯二酚为阳性对照[6],通过测定产物生成量来观察间苯三酚对COMT的抑制作用,以期为间苯三酚治疗痛经作用机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雌性昆明小鼠,体质量20～22 g,共40只,购自华中科技大学实验动物中心,使用许可证号:SYXK(鄂)2010-0057,生产许可证号:SCXK (鄂)2010-0009。实验前于25℃相对湿度60%清洁通风环境下饲养。

1.2 试药 3,4-二羟基苯甲酸(上海晶纯实业有限公司,批号:40230,纯度≥97.0%);4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(ACROS organics公司,批号:A02739066,纯度≥98.5%);S-腺苷甲硫氨酸对甲苯磺酸(上海晶纯实业有限公司,批号:24777,纯度≥80.0%,简称:SAM);间苯三酚(J&K chemical公司,批号:LN40M09,纯度≥99.0%);邻苯二酚(国药集团化学试剂有限公司,批号:20121016,纯度≥98.0%),其余试剂均为国产分析纯,实验用水为纯化水。

1.3 仪器 Agilent 1220型高效液相色谱仪(美国Agilent公司,DAD检测器);TGL-16B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);DW-86L386立式超低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司);WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司);SY-2-4恒温水浴锅(天津欧诺仪器仪表有限公司);万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.4 肝脏组织样品的制备 所有小鼠处死后,剖开其腹部,迅速取出肝脏组织置于冰冷0.9%氯化钠溶液中,用0.9%氯化钠溶液洗净后储存于-80℃冰箱中备用。用滤纸吸干组织表面的水分,称取1 g,以1∶3(W/V)的比例加入冰冷的磷酸盐缓冲液(pH=7.4)匀浆。匀浆液以15 000 r·min-1(r=10 cm)离心30 min,取上清液再次离心15 min,上清液部分为含COMT的粗酶液。

1.5 样品反应体系的制备 取含有0.2 mmol·L-1DBA、0.2 mmol·L-1SAM、2 mmol·L-1氯化镁的100 mmol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.8),加入粗酶液20 μL。随机分为A、B、C、D、E 5组,每组8只小鼠血浆。A组为空白对照组,B组为邻苯二酚组,C、D、E组分别为间苯三酚大剂量组、中剂量组、小剂量组。A组为空白,B组加浓度为1×10-3mol·L-1的邻苯二酚溶液10 μL,C、D、E组分别加浓度各为5×10-3,1×10-3, 2×10-4mol·L-1的间苯三酚溶液10 μL。各组反应体系的总体积均为1 mL,涡旋后在37℃下孵育60 min,加入冰冷的2 mmol·L-1高氯酸溶液160 μL以终止反应,冰浴10 min,15 000 r·min-1(r=10 cm)离心15 min,取上清液待测[7]。

1.6 色谱条件 色谱柱:Welchrom C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.7%醋酸水溶液(25∶75);检测波长254 nm;流速1.0 mL·min-1;进样体积20 μL;柱温30℃。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0版统计软件进行分析,各组数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较进行单因素方差分析,A组分别与其他组进行独立样本t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 专属性 在“1.6”项色谱条件下,空白小鼠肝脏组织样品、加入4-OH-3-MBA标准品的小鼠肝脏组织样品及反应体系样品的色谱图见图1所示,4-OH-3-MBA的保留时间为15.8 min,肝脏内源性物质不干扰样品测定,该方法专属性强。

2.2 线性关系考察 取4-OH-3-MBA标准品100 mg,精密称定,置100 mL棕色量瓶中,加适量流动相溶解后,定容摇匀,精密移取10 mL置于100 mL棕色量瓶中,制得质量浓度为100 μg·mL-1的标准品储备液。分别取储备液0.5,1.0,5.0,10.0,15.0 mL用流动相稀释得质量浓度为0.5,1.0,5.0,10.0,15.0 μg·mL-1的标准溶液,精密吸取各标准溶液20 μL,注入液相色谱仪进样分析,记录峰面积。以4-OH-3-MBA的质量浓度(ρ)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标进行线性回归,线性方程为:A=927 273.28ρ+84 596.03(r= 0.999 8),表明4-OH-3-MBA在0.5～15.0 μg·mL-1内质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

A.空白肝脏提取液;B.空白肝脏提取液中加4-OH-3-MBA;C.体系中加间苯三酚反应60 min;1.4-OH-3-MBA;2. DBA;3.未知物(不干扰测定)图1 肝脏提取液HPLC色谱图A.blank liver extraction;B.blank liver extraction spiked with 4-OH-3-MBA;C.reaction system spiked with phloroglucinol after 60 min;1.4-OH-3-MBA;2.DBA;3.unknown substance(without interference on analysis)Fig.1 HPLC chromatograms of liver extraction

2.3 检测限和定量限 取4-OH-3-MBA适量,分别加流动相稀释至主峰响应值约为基线噪音水平浓度3倍和10倍,作为最低检测限溶液和定量限溶液。各精密吸取20 μL注入液相色谱仪,进样测定,记录峰面积,计算最低检测限为1.7 ng,定量限为5.6 ng,线性关系在设定范围内能够满足定量要求。

2.4 精密度实验 取质量浓度为5.0 μg·mL-1的标准溶液,按照“1.6”项色谱条件,连续进样测定5次,记录峰面积,日内RSD为0.61%(n=5);取同样浓度的标准溶液,按“1.6”项色谱条件,连续5 d,每日进样测定1次,记录峰面积,日间RSD为0.72%(n=5)。表明该方法的精密度良好。

2.5 重复性实验 按照“2.2”项下标准品储备液的制备方法,配制质量浓度为5.0 μg·mL-1的标准溶液共5份,按照“1.6”项色谱条件,分别进样测定峰面积,重复性RSD为1.13%(n=5),符合测定要求。

2.6 稳定性实验 取样品反应体系溶液,于室温下放置,分别于0,2,4,8,12,24 h取样适量,照“1.6”项色谱条件测定峰面积,稳定性RSD为1.70%(n=6)。室温24 h内,样品溶液稳定性好,符合测定要求。

2.7 加样回收率实验 取空白肝脏组织匀浆液,按照“1.5”项制备方法(不加DBA),在0.5,5.0, 15.0 μg·mL-13个添加水平下进行加样(4-OH-3-MBA)回收率实验,每个浓度各设6个平行样。小、中、大3个剂量的加样回收率分别为95.6%,101.2%, 99.7%,RSD分别为2.71%,3.58%,3.13%,说明该方法准确度良好。

2.8 结果 见图2。结果表明:与A组比较,C、D、E组均差异有统计学意义(t分别为6.83,4.84,238,P＜0.05)。用抑制率来评价各组药物对COMT活性的抑制作用强弱。抑制率(%)=(各组产物浓度-空白对照组产物浓度)/空白对照组产物浓度×100%。经计算,B组抑制率为42.9%,C组抑制率为25.3%,D组抑制率为17.6%,E组抑制率为8.9%。

3 讨论

前列腺素类物质广泛存在于人体组织中,与许多生殖系统疾病如痛经等密切相关,痛经患者子宫内膜内前列腺素过高是造成该病发生的重要原因[8]。临床上常用非甾体抗炎药治疗痛经,该药通过抑制环氧化酶而减少前列腺素的生物合成来缓解痛经症状。在痛经患者子宫内膜异位症中,前列腺素水平与雌激素呈正相关[4],而COMT为雌激素代谢过程中的关键酶之一,肝脏COMT活性水平与肝脏雌激素代谢能力密切相关[9-10]。COMT催化2-或4-羟基雌激素的甲基化,生成2-或4-甲氧基雌激素,羟基雌激素、甲氧基雌激素已被证明有抑制或增强雌激素的作用,在鼠孕期COMT抑制剂能够调节子宫肌层的收缩与舒张[11]。

与A组比较,*1P＜0.01图2 间苯三酚与邻苯二酚对小鼠肝脏COMT活性的影响Compared with group A,*1P＜0.01Fig.2 Effect of phloroglucinol and catechol on COMT activity in the liver of mice

本研究通过与COMT阳性抑制剂邻苯二酚的对比研究,发现不同浓度的间苯三酚对COMT活性均有抑制作用,且剂量越大抑制作用越强,呈明显的量效依赖关系。说明间苯三酚的解痉机制可能与其抑制COMT的活性,从而影响雌激素代谢有关。本研究为进一步阐明间苯三酚解痉镇痛作用机制提供一种思路,同时也为治疗痛经的药物开发提供新途径。

本研究仅从间苯三酚体外抑制COMT活性的角度来说明其发挥解痉作用的可能途径,但间苯三酚也有可能通过某些离子通道的信号传导或通过其在体内的代谢物发挥药效,尚待进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.012

Determination of 4-Hydroxy-3-Methoxy Benzoic Acid by RP-HPLC and Inhibitory Effect of Phloroglucinol on Catecholamine-O-Methyl Transferase

YANG Rui-ling1,2,LIU Hong1,WANG Qi1,JI Ke-fei2,SONG Meng-jiao1
(1.Department of Pharmacy,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military,Wuhan 430070,China;2.College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

ObjectiveTo detect content of 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid by RP-HPLC and observe the inhibitory effect of phloroglucinol on catecholamine-O-methyl transferase(COMT).MethodsThis study used the principle of 3,4-dihydroxy benzoic acid transforming to 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid under COMT’s catalytic action.COMT(20 μL)was extracted from mouse liver homogenate.In a reaction system,10 μL catecol(1×10-3mol·L-1)and 10 μL phloroglucinol(5×10-3, 1×10-3and 2×10-4mol·L-1,respectively)were added.Products were determined by RP-HPLC to analyze effects of 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid on COMT.ResultsPhloroglucinol had inhibitory effect on COMT activity at concentrations of 5×10-3mol·L-1,1×10-3mol·L-1and 2×10-4mol·L-1,with the inhibition rate being 25.3%,17.6%and 8.9%,respectively.ConclusionPhloroglucinol has an inhibitory effect on COMT activity,which is weaker than the effect of catechol of the same concentration.

Phloroglucinol;Catecholamine-O-methyl transferase;HPLC;Inhibitory effect

R984;R927.2

A

1004-0781(2014)10-1303-04

2013-09-27

2014-02-08

杨瑞玲(1988-),女,湖北钟祥人,硕士,研究方向:药物制剂新技术与新剂型。电话:(0)13797077421,E-mail:ling19880611@126.com。

刘宏(1968-),男,湖北枝江人,主任药师,博士,研究方向:药物制剂新技术与新剂型。电话:027-68878601,E-mail:honguil@163.com。